[发明专利]一种麦芽糖诱导型海藻糖合酶合成工程菌及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种重组质粒载体，其特征在于，在PHT01质粒的BamHI酶切位点前插入麦芽糖诱导启动子替换PHT01质粒上的Pgrac启动子，在BamHI酶切位点前插入Tat型信号肽的表达基因，在BamHI酶切位点后插入海藻糖合成酶的表达基因；

所述的麦芽糖诱导启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，Tat型信号肽的表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示、海藻糖合成酶的表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种麦芽糖诱导型海藻糖合酶合成工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将权利要求1所述重组质粒载体转化枯草芽孢杆菌，制得重组枯草芽孢杆菌；

（2）在载体pGJ244的ApaI和EcoRI两个酶切位点之间插入启动子P43片段，在EcoRI和SacI两个酶切位点之间插入GAb片段，制得表达载体pCYL17；

所述在载体pGJ244的ApaI和EcoRI两个酶切位点之间插入启动子P43片段的步骤如下：

以枯草芽孢杆菌WB800n的基因组DNA为模板，用引物P43-1-up和P43-down PCR扩增P43启动子，将其克隆到pGEMT-Vector中，得到pGEMT-P43；

P43-1-up：TTGGGCCCTCAGCATTATTGAGTG

P43-down：GCGGAATTCATTCCTCTCTTACCTATAATG；

用ApaI和EcoRI消化pGEMT-P43，回收启动子P43片段，克隆到枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体pGJ244中，得到表达载体pGJ288R；

所述在EcoRI和SacI两个酶切位点之间插入Gab片段的步骤如下：

提取枯草芽孢杆菌WB800n的基因组DNA，以其为模板，用一对引物GlvA-bac-up和GlvA-bac-down，扩增枯草芽孢杆菌基因组中麦芽糖启动子下游500bp的GAb片段，回收GAb片段，将其克隆到pGEMT-Vector中，得到pGEMT-GAb，用EcoRI和SacI消化pGEMT-GAb，回收GAb片段，克隆到表达载体pGJ288R，得到pCYL17；

GlvA-bac-up：GCGGAATTCATGAAGAAAAAATCATTCTC

GlvA-bac-down：TTGAGCTCGGAATAATTGAGCATCC；

（3）在整合载体pE3的KpnI和ApaI两个酶切位点之间插入GAf片段，在SalI和BamHI两个酶切位点之间插入spec片段，制得整合载体PYG43；

所述在SalI和BamHI两个酶切位点之间插入spec片段的步骤如下：

以pDG1728为模板，用引物Spec-1-up和Spec-1-down PCR扩增1.1kb的壮观霉素抗性基因spec，将其克隆到pGEMT-Vector中，得到pGEMT-spec；用BamH1和Sal1消化pGEMT-spec，回收spec基因，克隆到pE3的相应位点，得到pGJ265；

Spec-1-up：TTGGATCCGAATGGCGATTTTC

Spec-1-down：GGCGTCGACTTGAAAAAAGTGTTTC；

（4）在整合载体PYG43的BamHI和SacI两个酶切位点插入步骤（2）制得的P43-GAb片段，制得整合载体pCYL25；

所述的启动子P43片段核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，GAf片段核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，GAb片段核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，spec片段核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

（5）将步骤（4）制得的整合载体pCYL25转化步骤（1）制得的重组枯草芽孢杆菌，筛选有壮观霉素抗性的克隆，制得麦芽糖诱导型重组枯草芽孢杆菌。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168衍生菌株WB800n。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，转化的步骤如下：

将感受态细胞在2500V、25uF的电击条件下转化，氯霉素筛选，即得。