[发明专利]一种可视化多色检测抗原‑抗体反应试剂盒及使用方法

说明书

一、技术领域

本发明属于免疫分析和诊断技术领域，具体涉及一种可视化多色检测抗原-抗体反应试剂盒及使用方法。

二、背景技术

酶联免疫吸附实验是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有反应快速，检测灵敏，操作简便，使用成本低廉，载体易于标准化等优点。

虽然酶联免疫吸附实验有诸多优点，但是由于需要使用酶标记的抗体来实现信号转导与输出，导致其每次只能单色的检测一种物质，极大地限制了检测效率，而且使用的酶如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶等易受到微生物或体内内源性氧化物酶或外源酶抑制剂(如叠氮化钠)的干扰，容易带来假阳性或假阴性的结果。最后，在低浓度目标分子存在下，往往需要20分钟以上的时间才可以读出可靠的结果，进一步延长了反应所需的时间。因此，现在存在对操作反应简单、体系稳定、可同时检测、灵敏度好，响应快速的免疫标记和检测技术的需求。

目前，利用纳米材料开发可同时检测多种抗原的免疫检测方法是当前开发新型免疫传感器的一个热门方向，例如，Fan小组报道了一种基于量子点的微流控平台来同时检测两种肿瘤标志物的方法，其利用的主要是微流控技术和具有不同发射光的量子点纳米颗粒(参考文献：Hu,M.；Yan,J.,He,Y.；Lu,H.,Weng,L.,Song,S.；Fan,C.,Wang,L.AcsNano,2010,4,488-494)；Wang小组报道了一种利用磁纳米颗粒的多通道微芯片来实现同时检测多种疾病标志物(参考文献：Gaster,R.S.,Hall,D.A.；Nielsen,C.H.,Osterfeld,S.J.,Yu,H.,Mach,K.E.,Wilson,R.J.,Murmann,B.,Liao,J.C.；Gambhir,S.S.,Wang,S.X.Nat.Med.2009,15,1327-1332)；Kelley小组报道了一种采用基于电化学平台的检测抗原抗体反应的方法，其主要采用了多种贵金属纳米颗粒标记抗体和电化学溶出技术(参考文献：Wan,Y.；Zhou,Y.,Poudineh,M.,Safaei,T.S.,Mohamadi,R.M.,Sargent,E.H.,Kelley,S.O.Angew.Chem.Int.Edit.,2014,53,13145-13149)。但是，可以同时多色可视化的检测出多种抗原抗体反应的免疫传感方法仍然处于探索阶段。

三、发明内容

本发明需要解决的问题是提供一种可视化多色检测抗原-抗体反应试剂盒及使用方法。

本发明所述试剂盒的由标记了甲基红修饰石墨烯的CEA抗体，标记了酚酞修饰石墨烯的NSE抗体，标记了百里酚酞修饰石墨烯的Cyfra21-1抗体和包被有CEA、NSE和Cyfra21-1单抗混合物的96孔板，pH值为12.0碱水，PBST缓冲液组成。

本发明所述试剂盒的使用方法：

(1)制备多抗体标记的96孔板：将多抗原的单抗以一定浓度比例混合后孵育96孔板，洗涤后再用胎牛血清或山羊血清或马血清进行封闭，封闭时间为30～120分钟，封闭温度为25～40℃，处理的目的是为了使标记的抗体能够与待测样品充分而稳定的反应。

(2)抗原抗体反应：向步骤1)中加入待测样品，洗涤后加入修饰有变色小分子的石墨烯标记的抗体，充分反应后去除未反应的多余石墨烯标记的抗体，所述变色小分子为甲基红(MR)，或酚酞(PP)或百里酚酞(TP)或溴甲酚紫(BP)或溴甲酚绿(BG)；优选为MR、PP和TP，MR、PP和TP与石墨烯分子的质量比分别为1：(13.4～53.8)，1：(15.9～95.4)，1：(4.3～43)。所述石墨烯标记的抗体为单抗或多抗。三种变色分子功能化石墨烯的抗体混合物中的浓度配比为1.5:1:0.5。所述抗原-抗体反应的孵育时间为30～120分钟，孵育温度为25～40℃；

(3)可视化检测：向步骤2)反应体系中加入碱性水，充分反应后根据反应体系颜色的变化判断样品中是否发生反应，所述碱性水pH值为10.0～13.0，用20mM氢氧化钠调配，所述反应体系的颜色变化在3～15分钟内出现。