[发明专利]一种定量检测B型钠尿肽的试剂盒及B型钠尿肽的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫分析检测领域，具体涉及一种定量检测B型钠尿肽的试剂盒，还涉及利用该试剂盒的B型钠尿肽的检测方法。

背景技术

B型钠尿肽（B type natriuretic peptide,BNP）是心衰的标志物，与充血性心力衰竭有密切关系，其主要来源于心室肌细胞，左心室容量或压力负荷的增加是刺激BNP分泌与释放的主要因素，BNP水平的增高已被视为心功能衰竭程度和慢性心力衰竭患者病死率的一个独立的预后指标。因而BNP成为当前国际上心血管疾病研究的热点之一。

目前，检测BNP主要有放射免疫法（RIA）、高灵敏度的免疫放射法（IRMA）、酶免疫法（EIA）、微粒子酶免疫法（MEIA）、免疫荧光法（FIA）等。RIA法有放射性污染，而IRMA法费时费力，自动化程度不高。目前国内外常用的实验室检测方法是电化学发光法，该方法结果精准，但是不能快速提供检查结果。

目前，关于BNP快速诊断试剂盒的研制处于起步阶段，其中获得抗BNP的抗体或多肽、并采用合适的方法将其应用于检测是制备BNP快速诊断试剂盒的关键技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种定量检测B型钠尿肽的试剂盒，能够快速、准确的定量检测BNP，特异性强，灵敏度高。本发明还提供了使用该试剂盒的BNP的检测方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是：

一种定量检测B型钠尿肽的试剂盒，其包括免疫磁珠和双抗体夹心荧光免疫ELISA试剂盒，所述双抗体夹心荧光免疫ELISA试剂盒包括抗体B型钠尿肽的单克隆抗体及免疫荧光ELISA缓冲液。

进一步的，所述免疫磁珠为抗B型钠尿肽的多克隆抗体通过链霉亲和素-生物素偶联纳米磁微粒制备。

进一步的，所述多克隆抗体由B型钠尿肽多肽段aar6-18，aar10-22和aar11-26混合免疫兔子得到的抗体混合物。

进一步的，所述免疫磁珠的制备方法为：将B型钠尿肽偶联KLH作为抗原免疫新西兰大白兔，所得抗B型钠尿肽血清经硫酸铵沉淀法进行纯化，待用；采用活泼酯的方法，将180nm磁珠与链霉亲和素偶联获得链霉亲和素磁珠，采用生物素化多抗与链霉亲和素磁珠连接制成链霉亲和素免疫磁珠，具体为：洗涤磁珠后，依次加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺和二氯乙烷，置于混匀仪上保持磁珠悬浮状态，37℃活化2h；将活化后的磁珠与链霉亲和素偶联，获得的链霉亲和素磁珠，再将其与待用的抗B型钠尿肽血清置于混匀仪上偶联，形成免疫磁珠，4℃冰箱保存备用。

进一步的，双抗体夹心荧光免疫ELISA试剂盒的一抗和二抗通过多肽合成的B型钠尿肽偶联KLH作为抗原免疫BALB/c雌性6周龄健康小鼠，按常规的杂交瘤技术和极限稀释法制备和筛选得到；一抗亚型是IgG1,亲和力常数在1×10¹⁰ L/mol，效价为20.48万，特异性良好；二抗选用选用碱性磷酸酶标记，二抗亚型是IgG2a，亲和力常数在1×10¹⁰ L/mol，特异性良好，并且一抗和二抗经相加试验计算相加指数AI=98.6%。

进一步的，所述一抗的包被缓冲液为0.01M PBS，pH7.2，包被浓度为2.5μg/mL。

进一步的，所述二抗与碱性磷酸酶标记摩尔比例为4：1。

进一步的，酶标二抗的浓度为1.65μg/mL，或1.8μg/mL，优选1.8μg/mL。

一种抗B型钠尿肽的检测方法，其选用所述试剂盒。

进一步的，其步骤为：将待测样品加入免疫磁珠中，洗脱得到上清液；取上清液加入包被有一抗的酶标板孔内，45℃温育30min；洗板，加入酶标二抗，45℃温育20min；洗板，加入荧光底物，45℃温育10min；荧光检测仪检测、读数并计算待测样品的B型钠尿肽含量。

本发明的有益效果在于，将纳米免疫磁珠分离技术与化学发光检测技术相结合，通过纳米磁珠偶联多抗，形成免疫磁珠进而来富集捕获样品中B型钠尿肽，再将捕获的B型钠尿肽进行基于双抗体夹心原理的免疫荧光ELISA，本发明试剂盒进行检测准确度高、特异性强、自动化程度高，而且为高通量检测，96个血样只需90min即可检出，其灵敏度可达9pg/mL。本发明选用三段抗原混合免疫兔子得到抗体，其多抗的免疫位点多样，提高了捕获的特异性和效率；本发明合成的ELISA一抗和酶标二抗相加指数AI=95.8%，两株抗体所结合抗原的不同构象表位且距离很远，特别适合于本发明双抗体夹心ELISA过程，能够大大提高检测的灵敏度。