[发明专利]一种中华鳖源胶原蛋白的纯化方法

权利要求书

1.一种中华鳖源胶原蛋白的纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)浸泡：取中华鳖裙边匀浆打碎，用碱性浸泡盐液中于4℃～10℃下放置24h～48h，蒸馏水反复洗涤，用纱布充分沥干后备用；

(2)去脂肪：将步骤(1)浸泡后的中华鳖裙边进行清洗，加入10％～15％异丙醇溶液于4℃～10℃浸泡24h～48h，以去除脂肪，蒸馏水反复洗涤，用纱布充分沥干后备用；

(3)酶解：将已去杂的中华鳖裙边置于0.5mol/L乙酸，料液比1:25，加入胃蛋白酶酶解液中进行酶解处理，4℃～10℃下提取24h～48h，得到中华鳖裙边胶原蛋白粗提液；

(4)盐析纯化：取步骤(3)的粗提液溶解于含有NaCl的Tris-HCl缓冲液中，离心取上清液，加入NaCl至上清液中，盐析，再次离心，分别收集沉淀和上清液；将沉淀溶解于0.5mol/L的乙酸中，透析后，冷冻干燥，即得中华鳖胶原蛋白冻干品。

2.根据权利要求1所述的中华鳖源胶原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述步骤(4)的盐析纯化过程中分别研究了时间、NaCl浓度、胶原蛋白浓度三个因素对胶原蛋白回收率的影响，其中，针对时间因素的研究方法为：取10mL的所述粗提液，均稀释粗提液胶原蛋白浓度至10g/L，并且均向其中加入3mol/LNaCl，在4℃下盐析1h、12h、24h、36h、48h；而针对NaCl浓度因素的研究方法为：取10mL的所述粗提液，分别加入1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L的NaCl，在4℃下盐析24h；而针对胶原蛋白浓度因素的研究方法为：取10mL的所述粗提液，分别稀释粗提液胶原蛋白浓度至2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L，均向其中加入3mol/LNaCl，在4℃下盐析24h。

3.根据权利要求2所述的中华鳖源胶原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述盐析的最佳组合为：时间为24h、NaCl浓度为3mol/L，胶原蛋白浓度为8g/L。

4.根据权利要求1所述的中华鳖源胶原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述步骤(4)的透析过程具体为：将所述沉淀溶解于乙酸后，用截留分子量分别为25KD、50KD、100KD的透析袋进行透析，透析液为纯水，在4℃～10℃下分别透析24h和48h，透析期间换水4～5次，取各透析时间的胶原蛋白溶液进行SDS-PAGE检测纯度，将透析后的胶原蛋白溶液冷冻干燥得胶原蛋白冻干品。

5.根据权利要求1所述的中华鳖源胶原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述碱性浸泡盐液的用量为所述中华鳖裙边质量的2倍～4倍。

6.根据权利要求5所述的中华鳖源胶原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述碱性浸泡盐液中含有NaCl和NaOH，所述碱性浸泡盐液中NaCl的质量分数为2％～4％，所述碱性浸泡盐液中NaOH的浓度为0.5％～1.5％。

7.根据权利要求1所述的中华鳖源胶原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述步骤(3)中酶解处理的温度为30℃～50℃，酶解处理的pH值为2～4，酶解处理的时间为8h～12h。