[发明专利]CIK及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞免疫技术领域，具体涉及一种CIK及其制备方法。

背景技术

过继免疫是将自身或异体的抗肿瘤效应细胞的前体细胞，在体外采用IL-2、抗CD3单抗，特异性多肽等激活剂进行诱导、激活和扩增后，再转输给肿瘤患者，从而提高患者抗肿瘤免疫力，以达到治疗的目的。目前在临床中使用最多的过继细胞免疫治疗主要是DC(dendriticcell，树突状细胞)治疗、CIK(Cytokine-InducedKiller，细胞因子诱导的杀伤细胞)治疗。其中，CIK是人外周血中单个核细胞在体外经多种细胞因子刺激后获得的一群异质细胞，它具有增殖能力强、杀瘤活性高和杀瘤谱广、临床应用不良反应小的特点，是肿瘤过继免疫治疗中更为有效的杀瘤效应细胞。

目前，对于CIK制备的方法都是采用多种细胞因子(IFN-α、IL-1α、IL-2和抗人CD3单克隆抗体)在体外联合诱导，较为经典和成熟的步骤可以参见CN102827808A号专利的描述和记载。其培养的过程中，首先按照常规方法将T淋巴细胞制备成CIK细胞，当细胞扩增至能满足临床治疗的细胞量时，加入IFN-α继续培养，既可以保证CIK细胞的数量，又可以提高其杀伤活性，MTT法检测表明利用CN102827808A号专利的方法培养的细胞较不加IFN-α培养的细胞对肿瘤细胞的杀伤性能高50％～1000％。经过对100多例临床恶性肿瘤患者治疗，有效率(PR+CR+MR+SD)达到76％，其中PR+CR+MR达50％，提升了CIK的能效。

但是上述通常采用的经典培养方法，其在实施过程中，诱导的时机是当细胞扩增至能满足临床治疗的细胞量时进行，已经得到的CIK细胞自身的形状和表面形态已经较为稳定，加入IFN-α继续培养提高其杀伤活性时，自身表面的结合簇的捕获能力并未增强，进行CD3CD56表型检测双阳性细胞比例约15％；由于其培养得到的CIK的产量本身是基于已经将细胞扩增至能满足临床治疗的细胞量，之后诱导过程继续扩增的倍数其实不高，而后续诱导扩增产生的形状变化的细胞才具有最佳的免疫性效果，而后续细胞扩增倍数较低，约100倍不足，高杀伤力的CIK的数量并不很高；而且CIK对于肿瘤细胞的识别捕获能力偏单一，使得过继免疫治疗效果上，仍然无法达到较理想的预期。

发明内容

本发明实施的目的在于克服现有CIK诱导扩增倍数、以及肿瘤识别捕获能力不足影响CIK杀伤力的缺陷，提供一种具有多种肿瘤捕获能力、且有效增殖倍数更多的CIK及其制备方法。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种CIK制备方法，包括如下步骤：

获取单个核细胞；

将所述单个核细胞用400～600U/mL的r-干扰素进行初次诱导培养；

将所述初次诱导培养后的细胞进行第二次诱导培养；其中，该第二次诱导培养于200～300U/mL的r-干扰素、90～110ng/mL的CD3单抗、90～110ng/mL的CD28单抗、8～12ng/mL的IL-1a和450～550U/mL的IL-2条件下进行；

将所述第二次诱导培养后的细胞进行第三次诱导培养；其中，该第三次诱导培养于40～60U/mL的r-干扰素、15～25ng/mL的CD3单抗、15～25ng/mL的CD28单抗、3.2～4.8ng/mL的IL-1a、450～550U/mL的IL-2和450～550U/mL的IL-15条件下进行。

本发明还提出一种由上述方法制备得到的CIK。

本发明的上述制备方法，采用将单个核细胞在不同的细胞性状阶段，用不同程度的细胞因子进行性状的改变；在逐步诱导培养的过程中，通过分步诱导，逐步改变其形状；而且在分步诱导的过程中逐步降低诱导形状改变的细胞因子(r-干扰素、CD3单抗、CD28单抗、IL-1a等)浓度以逐渐减缓和消除对其生长增殖倍数的抑制；并且逐渐的增加促进性状成熟和稳定的细胞因子的浓度(如IL-2)，使其细胞性状稳定，从而最终收获到增值倍数较高的性状多样稳定的CIK细胞。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实例提出一种用单个核细胞培养制备CIK的方法，包括如下步骤：

S10，获取单个核细胞；

S20，将单个核细胞用400～600U/mL的r-干扰素进行初次诱导培养；