[发明专利]沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测方法与应用。

背景技术

快速检测与鉴定致病性病原菌是及时有效的预防和控制病原菌传播的前提，对于畜禽业的健康正常发展以及食品的检验检疫安全和人类健康具有重要意义。

目前食品卫生微生物学检验(GB/T 4789.1—2003)病原菌仍主要依靠传统的细菌培养、血清学、生化鉴定等方法，检测周期长(需4～7d)，操作繁琐复杂，特异性、敏感度均较低，不能适应快速检测的需要。随着以核酸为基础的分子微生物检测技术的发展，特别是聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术的应用，使病原菌诊断技术发展到一个新的水平。PCR技术能够快速、灵敏地进行检测，并且已经在微生物检测方面获得了极为广泛的应用。后来，酶联荧光免疫检测法、金标试纸法、DNA探针技术、LAMP恒温扩增法等都逐渐出现在病原微生物检测领域。

目前的畜禽养殖都是规模化养殖，密度大，病原菌感染后传播快，而传统的病原菌检测方法操作繁琐，耗时耗力，不能起到有效地监测和预防作用，也很难指导发病后的合理用药。而目前对致病菌的检测方法如国标法、酶联荧光免疫检测法、聚合酶链式反应(PCR)、金标试纸法、DNA探针技术、LAMP恒温扩增法,这些方法都有存在不足之处，即检测通量不高。

多重PCR方法是提高检测通量的基本方法，可以在同一PCR体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段。不仅可以缩短检测时间，尤其适用于多种病原微生物同时存在的样品及复杂生态环境下的病原微生物检测方面。但多重PCR技术由于存在扩增偏好性,常常出现扩增效率不均衡问题，降低检测灵敏度甚至造成假阴性结果。

发明内容

本发明针对多重PCR存在的问题，采用靶序列富集多重PCR(target enriched multiplex PCR，Tem-PCR)技术，它的原理是针对待扩增的每一种靶序列，设计特异性引物，再编制一个通用引物(SuperPrimer)与之相联，形成嵌合引物，利用嵌合引物和通用引物(SuperPrimer)进行扩增。其独特之处在于嵌合引物的浓度极低，用在PCR的最初几个循环中富集目标序列。只有超级引物的浓度足以进行指数扩增，这样克服多重PCR的扩增偏爱性问题，可将传统多重PCR检测灵敏度提高2-3个数量级,解决了传统的多重PCR技术导致的假阴性结果问题。

本发明要解决的技术问题是提供用于沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测的引物。

本发明要解决的另外一个技术问题是提供一种沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测方法。

对于用于沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测的引物，本发明采用的技术方案是，包括：

(1)具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；或

(2)与(1)的核苷酸序列具有基本序列同源性，并具有相同功能的核苷酸序列。

对于沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测方法，本发明采用的技术方案是包括以下步骤：

(1)设计和合成引物；所述引物包括超级引物Fs和Rs、扩增沙门菌的外引物invA-F0和invA-R0、内引物invA-Fi和invA-Ri以及扩增大肠杆菌O78的特异性的内引物O78-Fi和O78-Ri和外引物O78-F0和O78-R0；

扩增沙门菌的外引物invA-F0和invA-R0、内引物invA-Fi和invA-Ri以及扩增大肠杆菌O78的特异性的内引物O78-Fi和O78-Ri和外引物O78-F0和O78-R0如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；

(2)样品DNA模板制备；包括：

a)取沙门菌或大肠杆菌O78的菌液1mL于12000r/min离心5min；沉淀加入100μL无菌水，混匀后，于100℃沸水浴10～15min，立即冰浴5min，12000r/min离心5min，上清液即为DNA模板；或