[发明专利]沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测方法

权利要求书

1.用于沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测的引物，其特征在于，包括：

(1)具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；或

(2)与(1)的核苷酸序列具有基本序列同源性，并具有相同功能的核苷酸序列。

2.采用权利要求1所述引物对沙门菌和大肠杆菌O78的双重Tem-PCR快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)设计和合成引物；所述引物包括超级引物Fs和Rs、扩增沙门菌的外引物invA-F0和invA-R0、内引物invA-Fi和invA-Ri以及扩增大肠杆菌O78的特异性的内引物O78-Fi和O78-Ri和外引物O78-F0和O78-R0；

扩增沙门菌的外引物invA-F0和invA-R0、内引物invA-Fi和invA-Ri以及扩增大肠杆菌O78的特异性的内引物O78-Fi和O78-Ri和外引物O78-F0和O78-R0如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；

(2)样品DNA模板制备；包括：

a)取沙门菌或大肠杆菌O78的菌液1mL于12000r/min离心5min；沉淀加入100μL无菌水，混匀后，于100℃沸水浴10～15min，立即冰浴5min，12000r/min离心5min，上清液即为DNA模板；或

b)取1g新鲜鸡粪加入5mL LB液体培养基，37℃，200rpm，增菌5h；低速离心5min；取1mL上清，12000rpm离心5min，弃上清，加入100μL ddH₂O悬浮沉淀，置100℃水浴煮沸10～15min；12000rpm离心3min，上清即为DNA模板；或

c)取奶粉5g加入100mL LB液体培养基中，高压灭菌后取1mL添加10倍梯度倍比稀释的沙门菌和大肠杆菌O78菌液各100uL，37℃250rpm增菌5h；12000rpm离心5min，弃上清，加入100μL ddH₂O悬浮沉淀，置100℃水浴煮沸10～15min。12000rpm离心3min，上清即为DNA模板；或

d)取10⁷cfu/mL的沙门菌和大肠杆菌O78用灭菌化妆水10倍比梯度稀释，分别取不同浓度的化妆水稀释菌液100uL加入900uL LB液体培养基中，37℃250rpm增菌5h；SDS法裂解制备DNA模板；

(3)双重Tem-PCR扩增反应；所述双重Tem-PCR扩增反应是以步骤(2)提取的DNA作为模板，采用双重Tem-PCR法进行扩增，扩增体系和反应条件如下：

2×PCR buffer 2μL，0.4mM dNTP，外引物invA-F0和invA-R0以及O78-F0和O78-R0各0.04μM，内引物invA-Fi和invA-Ri以及O78-Fi和O78-Ri各0.16μM，Fs和Rs各0.4μM，DNA聚合酶1U，MgCl₂2mM，DNA模板1.0μL，ddH₂O补足20μL；PCR扩增条件为：94℃，10min；94℃30s，56℃1min，72℃1min，10个循环；94℃15s，72℃90s，3个循环；94℃15s，56℃15s，72℃30s，25个循环；最后72℃后延伸5min；

(4)将PCR扩增反应产物进行琼脂糖电泳检测；将5μL所述扩增反应产物用1％琼脂糖电泳分离，根据条带有无和大小判定结果。

3.根据权利要求2所述的双重Tem-PCR快速检测方法，其特征在于，所述MgCl₂的浓度为2～3mM。

4.根据权利要求2所述的双重Tem-PCR快速检测方法，其特征在于，所述dNTP的浓度为0.2～0.5mM。

5.根据权利要求2所述的双重Tem-PCR快速检测方法，其特征在于，所述外引物的浓度从0μM到0.1μM；内引物的浓度从0.1μM到0.2μM。

6.根据权利要求2所述的双重Tem-PCR快速检测方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为Taq酶，浓度为1.0～3.0U。