[发明专利]一种全基因组外显子序列捕获探针的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因测序领域，具体地，涉及一种基于杂交原理的目标序列捕获系统，更具体地，涉及一种全基因组外显子序列捕获探针的构建方法。

背景技术

新一代测序技术的发展，为现代基因组学的研究打开了新的局面，然而全基因组测序的成本和分析的复杂程度还是让研究人员倍感困难，目标序列捕获技术的出现，缓解了这些问题。目标序列捕获测序是针对已知的特定基因组区域设计探针后进行的测序。外显子组捕获测序则是其中的一个特例，它是专门针对基因组中全部外显子区域的研究。全基因组外显子测序是利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。由于其具有对常见和罕见变异高灵敏度,能发现外显子区绝大部分疾病相关变异以及仅需要对约1％的基因组进行测序等优点,促使全基因组外显子测序成为鉴定如孟德尔疾病等疾病的致病基因最有效的策略,也被运用于复杂疾病易感基因的研究和临床诊断中。

目标序列捕获是指通过某种方法有选择性的分离或者富集基因组的特定片段。从这个定义看，目标片段的PCR也是目标序列捕获的一种，不过这种方法通量小，目前一次PCR获取最长的基因组DNA片段不超过50Kb,而且需要特殊的酶和特殊的PCR条件，成本昂贵，稳定性差。另一种捕获方法是根据核酸分子碱基互补的探针，将这些探针固定在某些支持物上，用于分离，然后打断基因组DNA，加上街头后与探针杂交，洗脱为杂交上的DNA，回收目标DNA片段，可直接建库进行DNA测序。

尽管已有商品化的外显子捕获试剂盒，但是目前的捕获物种有限，仅限于人类和鼠，成本极其昂贵(每个样品需350美金)等缺陷。

目前，市售的有安捷伦(Agilent)公司推出的SureSelect目标序列捕获系统以及罗氏NimbleGen推出的基于HD2平台2.1M外显子序列捕获芯片。其中，SureSelect目标序列捕获系统是RNA，难以保存，极易降解；与基于HD2平台2.1M外显子序列捕获芯片相比，实验过程简单，价廉。

发明内容

本发明的目的在于提供一种全基因组外显子序列捕获探针的构建方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提取正常血液中的总RNA，提取并打断mRNA；

(2)用SuperScriptⅡ(invitrogen)合成一链cDNA；

(3)合成invitrogen的二链合成混合液合成cDNA；

(4)补平末端，并在产物末端加A，连接接头；

(5)富集DNA片段。

步骤(1)打断mRNA的方法为：

用无核酸酶超纯水稀释总RNA，按1:1体积比(反应体系是50μL))加入纯化磁珠(RNAPurification Beads 15026778illumina)，在65℃孵育5min，放在磁力架上(DynaMag-2invitrogen)室温下孵育5min后，吸弃上清液，

从磁力架上拿下，按5：2体积比加入200μL洗脱液(150mM LiCl，20mM Tris HCl(pH 7.5)，1.0mM EDTA，0.01％Triton X-100)，放在磁力架上(DynaMag-2invitrogen)室温下孵育5min后，吸弃上清液，

从磁力架上拿下，加入50μL洗脱液(100mM Tris-HCl,pH 8.5，1.25M NaCl，按体积在80℃孵育mRNA洗脱液2min，按体积比1:1加入磁珠结合缓冲液(1M LiCl，40mM Tris HCl(pH 7.5)，2mM EDTA，0.1％Triton X-100)，放在磁力架上(DynaMag-2invitrogen)室温下孵育5min后，吸弃上清液，

从磁力架上拿下，加入200ul磁珠清洗液(150mM LiCl，20mM Tris HCl(pH 7.5)，1.0mM EDTA，0.01％Triton X-100)，放在磁力架上(DynaMag-2invitrogen)室温下孵育5min后，吸弃上清液，

加入25μL洗脱液((100mM Tris-HCl,pH 8.5，1.25M NaCl)，94℃孵育4min。

步骤(2)的合成一链cDNA的方法为：

将步骤(1)获得的17μL mRNA在磁力架(DynaMag-2invitrogen)静置5min，取上清液，