[发明专利]一种全基因组外显子序列捕获探针的构建方法

权利要求书

1.一种全基因组外显子序列捕获探针的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)提取正常血液中的总RNA，提取并打断mRNA；

(2)用SuperScriptⅡ(invitrogen)合成一链cDNA；

(3)合成invitrogen的二链合成混合液合成cDNA；

(4)补平末端，并在产物末端加A，连接接头；

(5)富集DNA片段。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤(1)打断mRNA的方法为：

用无核酸酶超纯水稀释总RNA，按1:1体积比(反应体系是50μL))加入纯化磁珠(RNA Purification Beads 15026778 illumina)，在65℃孵育5min，放在磁力架上(DynaMag-2 invitrogen)室温下孵育5min后，吸弃上清液，

从磁力架上拿下，按5：2体积比加入200μL洗脱液(150mM LiCl，20mM Tris HCl(pH 7.5)，1.0mM EDTA，0.01％Triton X-100)，放在磁力架上(DynaMag-2 invitrogen)室温下孵育5min后，吸弃上清液，

从磁力架上拿下，加入50μL洗脱液(100mM Tris-HCl,pH 8.5，1.25M NaCl，按体积在80℃孵育mRNA洗脱液2min，按体积比1:1加入磁珠结合缓冲液(1M LiCl，40mM Tris HCl(pH 7.5)，2mM EDTA，0.1％Triton X-100)，放在磁力架上(DynaMag-2 invitrogen)室温下孵育5min后，吸弃上清液，

从磁力架上拿下，加入200ul磁珠清洗液(150mM LiCl，20mM Tris HCl(pH 7.5)，1.0mM EDTA，0.01％Triton X-100)，放在磁力架上(DynaMag-2 invitrogen)室温下孵育5min后，吸弃上清液，

加入25μL洗脱液((100mM Tris-HCl,pH 8.5，1.25M NaCl)，94℃孵育4min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤(2)的合成一链cDNA的方法为：

将步骤(1)获得的17μL mRNA在磁力架(DynaMag-2 invitrogen)静置5min，取上清液，

按体积比4:1加一链合成混合液【50mM Tris-Acetate，75mM KOAc，3.1mM Mg(OAc)2，0.5mM dNTPs each】4μL，按照8:1体积比加入0.1M DTT【P/NY00147 invitrogen】2μL，按照16:1体积比10nMdNTP((P/NY00147 invitrogen】(1μL)进行孵育37℃2min，

加入SuperScriptⅡ5μL，

孵育程序为：37℃60min，4℃保存。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤(3)的合成二链cDNA的方法为：

按体积比1:1向步骤(2)的一链cDNA体系中加入二链合成混合液30μL【20mM Tris-HCl，12mM(NH4)2SO4，5mM MgCl2，0.16mMβ-NAD，0.19mM dNTPs each】；E.coli DNA Ligase(10units/μL【P/NY01181 invitrogen】1μL、E.coli DNA Polymerase(10units/μL【P/NY0116 invitrogen】4μL、E.coli RNase H(2units/μL)1μL，

16℃孵育2h，加入纯化磁珠90μL(_{AMPure XP beads} A63881)，移液器混匀10次，室温孵育15分钟，放在磁力架5分钟后，转移上清液135μL，

按照体积比7:10在上清液中加入80％的乙醇，吸去上清，重复一次，室温干燥15min，

加入52.5μL的重悬混合液(50mM Tris-HCl,pH 8.0 10mM EDTA)，

室温孵育2分钟，放置磁力架上5分钟后转移上清液。