[发明专利]一种猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗兔体效力检验方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种新型猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗效力检验方法。

背景技术

猪瘟(CSF)是由黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一种猪的高度接触性传染病，死亡率极高，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。我国面对这样烈性的染病一般都是采用疫苗和疫苗接种来提前预防，降低发病率和死亡率。猪瘟疫苗的发展经历了早期的灭活疫苗、弱毒疫苗、基因工程疫苗。目前广泛使用的是弱毒疫苗，我国批准使用的弱毒疫苗是由中国兽医药品监察所研制的猪瘟兔化弱毒疫苗。长期以来，猪瘟兔化弱毒疫苗的普遍使用，使CSFV野毒株及兔化弱毒抗原发生了变异，出现了慢性感染、隐性感染等非典型流行形式，很难区分猪群中的疫苗免疫猪和野毒感染猪，致使疫情难以控制，或造成免疫失败，这不但影响猪群中猪瘟的净化,而且给出口造成障碍。为此，研制更安全、更高效可以进行鉴别诊断的新型基因工程标记疫苗是全世界养猪业的迫切要求。

本实验室从pMD18-T-E0质粒、pMD18-T-E2质粒中扩增编码E0、E2基因,构建重组腺病毒穿梭质粒pAd Track-E0、pAd Track-E2。通过PET32a载体将E0和E2基因串联，形成PET-E0-E2，然后再将E0-E2克隆到腺病毒穿梭载体上得到重组腺病毒穿梭质粒pAd Track-E0-E2，转化到大肠杆菌BJ5183感受态细胞中，得到重组腺病毒骨架载体pAd Easy-E0-E2，转染人胚胎肾细胞(HEK293)，获得了含有目的基因的重组腺病毒(rAd-E0-E2)。

疫苗效力是评价疫苗质量的关键指标。生物制品研发、生产企业由于生产疫苗批次的不同，常常会导致最小免疫剂量有所差异。因此，对于每一种新研发出的疫苗有必要建立一种有针对性的配套检测该疫苗最小免疫剂量的方法。rAd-E0-E2作为本实验室最新研发的基因工程活载体疫苗，鉴于其没有一个更加稳定、简便、节省成本的疫苗效力评价标准。为此，我们建立了一种用于rAd-E0-E2的兔体效检模型，并确定其评价标准：将SPF兔接种10倍梯度稀释的rAd-E0-E2，14d后用猪瘟脾淋毒(1头份)攻毒，通过攻毒兔的体温变化、脾重/体重指数比(％)、脾脏病理组织变化、RT-PCR和IFA等评价方法共同判断rAd-E0-E2在兔体的免疫保护效力。该方法用小动物兔子代替了大动物猪，大大节省了生产检验成本；而且该检验方法使用的兔子均为SPF兔(无外源病毒和抗体干扰)，其生产性能和质量标准较猪更加稳定，可以进行疫苗生产质量评价应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗兔体效力检验的方法,该 方法主要按照如下步骤：

1.rAd-E0-E2冻干疫苗按照不同的稀释梯度(10^7.0、10^6.0、10^5.0IFU/ml)免疫兔体后第14天，用猪瘟脾淋毒(1头份)接种兔的耳缘静脉攻毒，于攻毒后连续3天每6h检测兔体反应热；

2.攻毒后第3天剖杀兔，称兔体重和脾脏重量，计算兔脾脏/体重指数比；

3.将兔脾脏放于10％福尔马林固定、做组织切片，显微镜观察兔脾病理学变化；

4.将兔脾称取1g提取脾脏总RNA,采用RT-PCR方法检测猪瘟脾淋毒的存留情况；

5.将兔脾组织低温下研磨，通过0.22um滤膜过虑除菌，滤液接种ST细胞，盲传3代后，进行IFA鉴定是否有猪瘟脾淋毒感染细胞；

6.判定方法：当兔体温均＜40.5℃、兔脾脏/体重指数比mean≤0.055％、兔脾组织显微观察未出现充淤血、RT-PCR均检测不到猪瘟脾淋毒基因存留和IFA病毒分离均为阴性同时成立时，判为该疫苗保护兔体免受猪瘟脾淋毒的攻击；当其中任何一项检测均不在此范围内时，判为该疫苗未能保护兔免受猪瘟脾淋毒的攻击。

通过此方法来评价该疫苗的保护效力和最小免疫剂量为10^7.0IFU/ml，建立了rAd-E0-E2兔体效力检验方法，可以更加稳定、简便、节省成本的评价该疫苗的免疫效力，从而弥补现有技术的不足。

附图说明

图1：免疫前、后体温测定及结果图，

图2：攻毒前、后体温测定及结果图，

图3：攻毒后脾重/体重指数比图，

图4：攻毒后脾脏病理变化图。

具体实施方式