[发明专利]新型shRNA表达载体及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及新型的shRNA表达载体及其制备和应用。

背景技术

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是真核生物中由双链小RNA分子(small interfering RNA，siRNA)介导的RNA降解现象，最初在秀丽线虫中被发现，此后发现RNAi现象在果蝇、拟南芥、斑马鱼和哺乳动物等多种真核生物中都是高度保守的。由于RNAi可以被用来特异性关闭靶基因的表达，具有极大的应用价值。因此，自1998年被发现以来，RNAi多次入选Science杂志评出的年度十大科学进展，并名列2002年十大科学进展之首。2006年，Craig Mello和Andrew Fire因发现RNAi现象而被授予诺贝尔生理医学奖。目前大量生物技术公司和国际大制药企业投资进入RNAi技术开发和应用领域，其中针对呼吸道合胞体病毒感染(Respiratory syncytial virus infection)以及湿性年龄相关性黄斑变性病症(Wet age-related macular degeneration)等几种疾病的RNAi治疗已进入二期和三期临床试验。另外针对乙型肝炎(Hepatitis B)、实体瘤(solid tumors)以及先天性厚甲症(Pachyonychia congenita)等疾病的RNAi药物也已进入一期或二期临床试验。

RNAi中的关键功能分子是长度约为21个核苷酸的siRNA，最初应用时主要依靠化学方法合成，这种方法获得的siRNA虽然能有效抑制目的基因的表达，但容易被细胞代谢清除，作用持续时间较短，且合成成本较高，每毫克siRNA的化学合成成本需要上千元。为了长期稳定表达siRNA，研究人员设计开发出了由细胞内自身的RNA聚合酶Ⅲ(RNA polymeraseⅢ)启动子，如H1，U6等转录产生的siRNA表达载体。其中目前应用最广的是shRNA(short hairpin RNA)。转录产生的shRNA被细胞内的核酸酶Dicer进一步加工后产生成熟的siRNA，发挥沉默靶基因表达的效果。

目前使用的shRNA载体由于其自身特点而在实际应用时存在一些缺点，主要包括：(1)效率不高。往往需要设计多个shRNA才能保证有1-2个shRNA能对靶基因达到70％以上的抑制效果。(2)脱靶作用(off-target)。siRNA通过与mRNA部分互补配对，以类似miRNA的作用方式非特异性抑制靶基因以外其它基因的表达。

综上所述，本领域急需开发对靶基因抑制效率更高的RNAi载体，从而更好地应用于科学研究和疾病治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以引发RNA干扰(RNAi)的新型shRNA表达载体及其制备方法和应用，所述shRNA表达载体的加工效率和对靶基因的抑制效率更高，因此在研究基因功能和基因治疗等方面具有极大潜力。

在第一方面，本发明提供一种核酶增强型shRNA，所述核酶增强型shRNA的核苷酸序列从5′端到3′端依次具有以下区域：

(a)5′端配对区域，所述5′端配对区域长度大于或等于19nt；

(b)顶端环区域，所述顶端环区域长度大于或等于2nt；

(c)3′端配对区域，所述3′端配对区域长度大于或等于19nt，并且所述5′端配对区域与3′端配对区域形成双链区域，所述双链区域长度大于或等于19bp；

(d)3′端未配对区域，所述3′端未配对区域长度为0-6nt；

(e)与3′端未配对区域相连的核酶区，所述核酶区编码具有自切割功能的核酶；

其中，所述核酶增强型shRNA产生siRNA，且所述siRNA的核苷酸序列对应于所述3′端配对区域或5′端配对区域。

在另一优选例中，所述5′端配对区域长度为19-28nt，更佳地为20-25nt。

在另一优选例中，所述顶端环区域长度为2-12nt，更佳地为3-10nt。

在另一优选例中，所述3′端配对区域长度为19-28nt，更佳地为20-25nt，并且所述5′端配对区域与3′端配对区域形成双链区域，所述双链区域长度为19-28bp，更佳地为20-25bp。

在另一优选例中，所述的3′端配对区域为shRNA的靶向链(guide strand)。

在另一优选例中，所述的3′端未配对区域为2nt。

在另一优选例中，所述的核酶的3′端具有4-6个连续的U。