[发明专利]一种人免疫活性细胞DC-CIK细胞制剂及其有效制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人免疫活性细胞DC-CIK细胞制剂及其有效制备方法。

背景技术

近年来，随着生物技术的发展，研究发现非特异性免疫细胞可以杀伤癌细胞的干细胞，防止癌细胞的复发和转移(R.Tallerico et al，The Journal of Immunology，2013，190(5):2381-90)。目前应用最多的非特异性免疫细胞治疗方法是CIK细胞、DC-CIK细胞治疗。

树突状细胞（dendritic cell，DC）是目前研究发现的人体内功能最强的专职抗原提呈细胞（antigen presenting，APC）它能识别抗原，激活获得性免疫系统；而细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killers，CIK细胞)是一种增殖能力强，非特异性杀伤癌细胞的免疫细胞。

DC细胞就像“雷达”，能识别抗原，激活免疫应答；CIK细胞就像“导弹”，能通过发挥自身细胞毒性，分泌细胞因子，精确杀伤肿瘤细胞。“雷达+导弹”产生了一个高效和谐的免疫系统。临床证明，DC-CIK细胞疗法能克服手术、放疗、化疗三大传统治疗方式的“不彻底、易转移、副作用大”等弊端，部分患者可提高三到五年生存率，是国际公认的有望消灭癌细胞的肿瘤治疗新技术。

研究证明DC细胞与CIK细胞共培养后产生的细胞比同源CIK细胞具有更强的增殖活性，DC细胞能促进CIK细胞的增殖，提高CIK细胞的抗癌细胞活性，同时DC-CIK细胞共培养时上清液也能促进DC细胞的成熟（Marten，A et al J Immunother，2001，24(6):502-510）。

DC-CIK细胞的常规培养方法都是先从人外周血单个核细胞（PBMC）中分离出贴壁的单核细胞和悬浮的淋巴细胞后再分别诱导，等到单核细胞诱导出成熟的DC细胞后再与悬浮的淋巴细胞共同培养，该方法操作繁琐，容易造成污染，增殖速度慢，需要培养20天以上。近年来有人对DC-CIK细胞的培养方法进行了改进，直接在单个核细胞的培养基中加入细胞因子和刺激因子，简化了操作步骤，培养时间也有所缩短，但仍需15～17天，且所得的DC-CIK细胞对癌细胞的杀伤活性不够强，只能达到32.9%。根据以往的研究报道可知，在免疫细胞培养过程中，细胞因子的添加种类、添加顺序、添加量是影响免疫细胞增殖速度和杀伤活性的主要因素，因此可以通过优化DC-CIK细胞培养方案来达到提高DC-CIK细胞的增殖速度和杀伤活性。由于DC-CIK细胞的常规培养方法培养时间长且培养所得的DC-CIK细胞杀伤活性低，这些缺陷阻碍了DC-CIK细胞在临床上的推广应用。因此缩短DC-CIK细胞的培养时间与提高DC-CIK细胞的杀伤活性是当前需要解决的问题。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题和缺陷，即DC-CIK细胞增殖速度慢和对癌细胞的杀伤活性低，本发明通过优化培养方案来达到提高DC-CIK细胞的增殖速度和对癌细胞的杀伤活性，目的是提供一种人免疫活性细胞DC-CIK细胞制剂及其有效制备方法。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种人免疫活性细胞DC-CIK细胞制剂的有效制备方法，具体包括以下步骤：

（1）从人外周血中分离单个核细胞；                                    

（2）将单个核细胞接种到无血清培养基中，加入IFNγ、GM-CSF、IL-4，培养1天；

（3）加入IL-2、IL-15、抗CD3单抗培养2天；

（4）加入TNFα，继续培养1天促进DC细胞的成熟；

（5）加入IL-2和IL-15继续增养8天，即得DC-CIK细胞；

（6）离心收集（1～5）×10⁹细胞，用0.9%生理盐水洗涤2次，离心后弃上清，将细胞移至100ml输液瓶中，并添加5ml 20%人血清白蛋白和100ml 0.9%的生理盐水，制作成细胞悬液，即一种人免疫活性细胞DC-CIK细胞制剂。

进一步的，所述步骤（1）中的单个核细胞是采用人淋巴细胞分离液密度梯度离心的方法制备。

进一步的，所述步骤（2）中的单个核细胞的细胞浓度调整为2x10⁶/m1。

进一步的，所述步骤（2）中的无血清培养基由AIM-V、LonzaX-VIVO15和RPMI 1640培养基以1:1:1的比例配制而成。