[发明专利]一种用于生物样本的核酸提取方法及试剂

说明书

本发明涉及核酸提取领域，具体讲，涉及一种用于生物样本的核酸提取方法及试剂；具体方法为：将生物样本中先加入氢氧化钠溶液，然后加入裂解液进行裂解，得到裂解反应液；所述的裂解液中含有胍盐、乙二胺四乙酸二钠、表面活性剂和缓冲剂；再在裂解反应液中加入乙醇溶液，最后采用带有硅胶膜的无仪器核酸提取装置或离心柱实现核酸的吸附、清洗和洗脱。本发明采用了先加氢氧化钠预处理、再加入裂解剂进行裂解的方式，可以更好地溶解样本中的蛋白质，并促进核酸与吸附膜的结合。本发明还优化了裂解液组分，显著增强了核酸分子在高盐高pH条件下与硅胶膜的结合能力，确保了良好的核酸提取效率。

技术领域

本发明涉及核酸提取领域，具体讲，涉及一种用于生物样本的核酸提取方法及试剂。

背景技术

核酸提取是许多临床检验工作的首要环节。该环节下获得的核酸模板，其浓度和纯度直接影响了后续检验结果的准确性。离心柱法是临床检验中常见的核酸提取方法。该方法利用核酸分子在高盐低pH环境下与硅胶膜结合，低盐高pH环境下与硅胶模解离的特性，可从痰液、血液、尿液等多种类型的样本中特异性地富集和纯化核酸模板。配合高速离心机或自动化的核酸提取仪，离心柱法具有通量大、速度快、提取效率高、模板纯度好等优点，能满足大多数临床实验室的检验要求。除离心柱法外，市场上还出现了不依赖离心机的无仪器核酸提取装置。这种装置以注射器的手工推吸作用替代了离心机的离心沉降作用，使用时无需电源、且操作简便、通量灵活，更加符合基层医疗单位开展分子诊断工作的实际需求。

市场上现有的细菌或细胞基因组核酸提取产品，大多采用离心的方式，首先分离临床样本的沉淀物与上清液，并丢弃上清液，仅将沉淀物用于后续的核酸提取，以减少抑制物残留对后续检测结果的影响。这种“丢弃上清液、保留沉淀物”的核酸纯化方式仅适用于新鲜未降解的临床样本，而那些经过高温灭活或冷冻储存的临床样本，往往伴有细菌或细胞裂解的情况，其结果导致大量的基因组核酸游离在上清液中。丢弃上清液无疑将损失大量的核酸模板，降低后续检测的灵敏度，因此需要一种既能保留上清液，又能减小上清液中抑制物残留的核酸提取方法。

此外，如何充分裂解样本也是核酸提取的技术难点之一，这对无仪器核酸提取装置尤为重要。由于手工操作的力量远远小于高速离心机，无仪器核酸提取装置往往采用孔径更大的硅胶膜过滤样本，以减小滤膜堵塞的风险。但仅仅使用大孔径的滤膜和常规的核酸提取试剂还无法使该装置适用于蛋白质含量较高的临床样本，如全血、血浆等，因此需要一种溶解效果更好、裂解效率更高的核酸提取试剂。

针对上述两个问题，现已公开了一些改良的核酸提取技术和试剂：

专利ZL200910032536.0公开了一种硅胶膜型DNA快速提取及保存DNA的方法，该专利采用高盐低pH条件吸附DNA，通过一种含有细胞裂解剂、核酸酶抑制剂的溶液处理硅胶膜后，无需预先提取DNA的过程，直接将细胞裂解并将DNA吸附在硅胶膜上，同时由于核酸酶抑制剂的存在，该吸附DNA的硅胶膜可长期保存，避免DNA的降解。该专利中公开的方法虽然可以用于DNA的保存，但其裂解液为低pH条件，溶解蛋白质的能力较差，容易造成无仪器核酸提取装置的堵塞，因而仅适用于离心柱式的核酸提取方法。

专利申请201010621890.X公开了一种用于生物样品中核酸提取纯化的细胞裂解试剂，该试剂溶液呈碱性并含有胍盐、铵根离子及表面活性剂成分，在碱性液相环境下能更充分裂解生物样品中的细胞，并能促进释放到细胞外的核酸(DNA/RNA)与固相材料的结合吸附，最后通过洗脱步骤将核酸从固相材料上分离下来。该专利申请中虽然公开了pH 8～13的碱性裂解条件，但通过添加铵根离子仅能使裂解液的pH达到9左右。而通入氨气虽然能达到更高的碱性条件，但氨气易挥发，不便于长期稳定保存。