[发明专利]血清ssc‑miR‑194b作为检测仔猪肠道应激损伤分子标记物的应用

说明书

技术领域

本发明属于家畜基因工程技术领域，具体涉及血清ssc-miR-194b作为检测仔猪肠道应激损伤分子标记物的应用。

背景技术

仔猪断奶应激是全世界生猪养殖中的一大难题，每年都给养猪业造成巨大的经济损失。应激导致的仔猪腹泻，更是目前养猪生产中最常见和危害性最大的一种应激性疾病。断奶应激主要的靶点是仔猪的胃肠道，其中对小肠的损伤尤为严重。断奶应激引发的仔猪小肠组织损伤和重建严重影响了仔猪肠道的发育和成熟，从而制约了仔猪的健康和生长。同样，断奶应激引发肠道损伤致使胃肠酶合成和吸收能力的下降被认为是断奶仔猪腹泻的原发性因素(伍晓雄，1999)；肠黏膜受损是导致仔猪腹泻的主要原因之一(严宏祥等，2006)。故断奶期被认为是肠道发育的一个重要时期，在这个时期由于仔猪的肠道尚未发育成熟，断奶应激有可能对仔猪肠道健康造成终生影响(Smith et al，2010)。

目前，肠道受损最有力的直接证据是将仔猪屠宰后进行肠粘膜形态学变化的检测。肠绒毛高度的降低和隐窝深度的增加是研究报道中证实肠粘膜结构受损的一项最主要的指标(Nabuurs等,1993)。然而，屠宰破坏性的研究只能用于研究机理的阐述。若能通过非屠宰的方式，例如在血液中发现可靠的反映肠道应激损伤的指标，对于尽早预防、诊断和治疗肠道应激损伤、提高养猪生产性能、增加养猪经济效益，以及特别是将其作为分子标记物应用于猪分子育种中提高生猪整体健康水平，均具有非常重要的生产实践意义和科学意义。因此，科学家们对断奶仔猪血清/血浆中二胺氧化酶(DAO)活性、D－乳酸含量和皮质醇含量等的变化进行了相关研究(钱仲仓等,2009；钟武装等，2013；胡彩虹等，2013；黄其春等，2014；Wolvekamp等，1994；黎君友等，2000；胡泉舟，2007)。但上述指标变化的检测均为相对值，要求有相应对照样品做参比并通过对数据进行显著性差异分析才能得出结论，因此不具备诊断价值。

血清/血浆miRNAs的发现无疑是miRNAs研究领域中的一项重大突破，为miRNAs在动物上的研究提供了新的研究思路。现有研究证实血清miRNAs不仅存在且具有广泛性、稳定性和特异性，特别是具有无创性和便捷性等无可比拟的优点。此外，它的变化与机体的生长发育、疾病发生发展和应激等多种生理现象密切相关。Mitchell等(2008)首先在肿瘤患者血浆中证实了miRNAs的存在。几乎同时，Chen等又在健康人类、肺癌、结肠癌和糖尿病等疾病患者以及包括鼠、牛和马等动物血清和血浆中检测到了多种miRNAs，并证实miRNAs在血清和血浆中无显著差异、且其含量几乎不受室温、高温、pH、多次冻融的影响。Gilad等(2008)通过比较妊娠妇女血清、尿液、唾液、羊水和胸膜液中的miRNAs，认为血清miRNAs更适合作为一种新型生物标记物。Blondal等(2013)指出当机体发生病理变化时，miRNAs可快速从组织释放到体液。提示血清循环miRNAs具有及时、特异性反映机体生理状态的优势。已有报道表明血清/血浆miRNAs的检测有助于诊断组织器官损伤(Redell等,2010)、关节炎(Murata等,2010)、心血管系统疾病(Tijsen等,2012)、肝炎(Zhang等,2012)和糖尿病(Guay等,2013)等多种疾病，特别是在各种恶性肿瘤方面的研究成果更为丰富(Liu等,2013；Madhavan等,2013；Sozzi等,2014)。

发明内容

本发明的目的针对现有技术的不足，提供血清ssc-miR-194b作为检测仔猪肠道应激损伤分子标记物的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

血清ssc-miR-194b作为检测仔猪肠道应激损伤分子标记物的应用，所述ssc-miR-194b的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述ssc-miR-194b的反转录引物(茎-环引物)如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述ssc-miR-194b正向引物如SEQ ID NO.3所示，ssc-miR-194b反向引物如SEQ ID NO.4所示。

上述应用包括以下步骤：

(1)收集断奶仔猪全血，制备血清样品；

(2)采用Plasma/Serum Exosome Kit(Norgen，49200)试剂提取血清样品中total RNA；