[发明专利]血清ssc‑miR‑194b作为检测仔猪肠道应激损伤分子标记物的应用

权利要求书

1.血清ssc-miR-194b在制备检测仔猪断奶肠道应激损伤分子标记物的应用，其特征在于，所述ssc-miR-194b的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ssc-miR-194b的反转录引物如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ssc-miR-194b正向引物如SEQ ID NO.3所示，ssc-miR-194b反向引物如SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，该应用包括以下步骤：

(1)收集断奶仔猪全血，制备血清样品；

(2)采用Plasma/Serum Exosome Kit试剂提取血清样品中total RNA；

(3)采用miRNeasy Mini Kit试剂盒提取total RNA中的小分子RNA；

(4)采用如SEQ ID NO.2所示的ssc-miR-194b反转录引物对小分子RNA进行反转录，获得cDNA：所述反转录体系为：小分子RNA样品2.5μl，浓度为40ng/μl、ssc-miR-194b反转录引物0.5μl，浓度为2μM、dNTP 0.25μl，浓度为10mM each、5×RT buffer 1.0μl、RNase inhibitor 0.25μl，浓度为40U/μl、M-MLV 0.5μl，浓度为200U/μl，反应体系总体积为5.0μl，将均匀混合的反应体系放置42℃反应60min，再放置70℃反应15min，4℃保存；

(5)以U6为内参，采用ssc-miR-194b的正向引物和反向引物对cDNA进行荧光定量PCR；反应体系为：步骤4得到的cDNA 1.0μl、2×SYBR Green Mix 10.0μl、RNase-free Water 8.2μl、SEQ ID NO.3所示的ssc-miR-194b正向引物0.4μl，浓度为10μM，SEQ ID NO.4所示的ssc-miR-194b反向引物0.4μl，浓度为10μM，反应体系总体积为20.0μl；荧光定量PCR反应条件：50℃反应2min、95℃反应5min；然后95℃反应15s、60℃反应15s，40cycles；

(6)荧光定量PCR结果ΔCt值若为负值，则表明断奶仔猪肠道应激损伤；若荧光定量PCR结果ΔCt值为正值，则表明断奶仔猪肠道没有发生应激损伤。