[发明专利]一种细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞的制备方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种细胞寿命延长及成血管能力增强的人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)的制备方法，其特征在于，

将T-STAR和Angl序列通过PCR从正常人外周血基因组DNA中扩增下来，将T-STAR和Angl分别经PacI/AscI双酶切后，分别得到双酶切后的T-STAR和Angl，pLenti6.3_MCS载体经PacI/AscI双酶切后，将所述双酶切后的T-STAR、Angl分别与双酶切后的载体在T4DNA连接酶作用下，于4℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定，得到慢病毒表达质粒；

取细胞状态良好，处于对数生长期的293T细胞，细胞计数后，按照每个直径为10cm的培养皿6×10⁶个细胞数接种于培养皿中，37℃，5％CO₂的培养箱中培养过夜；第二天转染前移去培养液，换5ml Opti-MEM培养液；取9μg Packaging Mix和3μg慢病毒表达质粒加入1.5mlOpti-MEM中，轻轻混匀，得到质粒溶液，取36μl lipofectamine2000加入1.5ml Opti-MEM中，轻轻混匀，室温放置5min，得到lipofectamine2000稀释液；混合质粒溶液和lipofectamine 2000稀释液，置室温20min，得到质粒脂质体复合物；将3ml质粒脂质体复合物加入到293T细胞培养皿中，混匀，37℃、5％CO₂的培养箱中孵育6个小时后，更换完全培养液DMEM，获得转染后的293T细胞；48h后收集细胞培养上清，3000rpm离心10min，去除细胞和碎片，并用0.45μm的滤器过滤；将病毒原液在50000g下超速离心2小时，去除上清，重悬于opti-MEM培养液中，滴度测定后分装成小管保存于-80℃，转染人骨髓间充质干细胞；

通过荧光定量PCR试剂盒按照使用说明书检测，转染了T-STAR和Angl双病毒载体的hBMSCs传代培养到第10代后，其表达T-STAR和Angl基因均高于未转染的hBMSCs，分别为27.8和20.7倍。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，

重组T-STAR和Angl双慢病毒载体转染的hBMSCs通过完全培养液DMEM体外传代培养，当细胞培养到第5-6天，细胞生长融合达到90％以上，需要使用质量体积比为0.25％的胰酶消化传代。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，

通过瑞士罗氏公司TeloTAGGG端粒酶PCR ELISAPLUS试剂盒检测，取传代培养获得第10代转染了重组T-STAR和Angl双慢病毒载体的hBMSCs，根据使用说明书检测其相对端粒酶活性。