[发明专利]一种细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞的制备方法及其试剂盒

说明书

本发明提供一种细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞的制备方法，其中，所述方法包括构建RNA睾丸信号转导与激活子和血管生成素‑1的基因片段，重组到病毒表达载体上，转染人干细胞可延长细胞的寿命，并提高人干细胞的成血管能力，且无成瘤性；本发明还提供了延长细胞寿命和成血管能力的人干细胞的试剂盒，该人干细胞将有望对缺血性心脑血管疾病的达到较好的治疗效果。

技术领域

本发明涉及一种细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞的方法以及通过所述方法获得细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞，特别地，本发明涉及构建RNA睾丸信号转导与激活子和血管生成素-1的双基因的重组慢病毒载体，使得人干细胞能过表达RNA睾丸信号转导与激活子和血管生成素-1；本发明的细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞增殖活性和端粒酶活性提高，延长了人干细胞寿命，促进了新生血管形成，而无成瘤性，可望用于临床治疗缺血性心脑血管疾病，提高了受损部位血供，促使了受损神经细胞的修复。

背景技术

目前动物体内实验和临床研究工作，证实成体干细胞移植治疗缺血性心脑血管疾病有治疗效果，促进了缺血部位的新血管再生提高患者的功能状态，改善患者的生活质量。成体干细胞应用细胞治疗的主要优势在于其可以自体移植，因而不存在胚胎干细胞移植所存在的免疫排斥、伦理学及致瘤性等方面的限制，具有良好的临床应用前景。但是成体干细胞在体内数量稀少，用于自体移植需要在体外大量扩增，才能满足细胞治疗的需要。

然而，成体干细胞同大多数的成体细胞一样，会发生衰老，主要表现在两个方面：①随年龄增长，BMSCs的数量和质量均有明显下降(而老年人正是缺血性心脑血管病的高发人群，是可能的需要细胞移植治疗的主体)；②在体外扩增过程中，细胞的增殖能力、分化潜力、乃至向病灶区归巢的能力均会逐渐丧失。这严重限制了成体干细胞自体移植的临床应用。

本发明利用人于细胞修复和“归巢”特性，将构建好的能过表达RNA睾丸信号转导与激活子和血管生成素-1，使得人干细胞能延长细胞寿命，增强成血管能力，而无成瘤性。人干细胞来源方便，主要包括人基质干细胞、内皮祖细胞、神经干细胞和胚胎干细胞等，细胞培养获得简单，可以做到个体化，也可以作为异体规模化生产。因而，本发明细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞制备简单，促进缺血区的新血管再生，创造有利于神经再生的微环境，有望对缺血性心脑血管病较好的治疗效果，能个体化临床治疗，也能作为规模化生产的产品应用于临床治疗缺血性心脑血管疾病。

发明内容

许多基础研究及临床研究已经证实，干细胞在治疗缺血性心脑血管疾病中发挥着独特的功能，能促进缺血区的新血管再生及神经再生，修复受损的组织，同时也能分泌神经营养因子和细胞因子，改善机体微环境。然而临床使用的人干细胞均需要在体外大量扩增培养，保证足够的数量进行临床治疗。人成体干细胞均有寿命，一旦体外扩增到几代后就出现生长速率减缓，其端粒变短，分化潜能减弱、“归巢”能力降低和成血管能力也大打折扣。

人干细胞衰老分子机制还不清楚，研究证实端粒酶活性降低使得端粒变短是一个非常重要的原因。RNA睾丸信号转导与激活子(testis-signal transduction andactivator of RNA，T-STAR)参与酪氨酸蛋白激酶信号传递并通过介入端粒酶反转录酶的磷酸化促进端粒酶活化，从而催化TTAGGG重复序列增加到染色体末端，以维持端粒长度，也是保持细胞复制活性的关键因素。

血管生成素-1(angiopoietin-1，Angl)在胚胎发育过程中血管生成和成年人血管再生的关键因子。研究发现Angl在神经保护，以及局部脑出血后神经生长和血管生成中起到重要的作用。