[发明专利]一种精子DNA碎片检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生化检测技术领域，尤其属于DNA检测技术领域，特别涉及一种精子DNA碎片检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

遗传物质的完整性对于成功妊娠和子代的健康是至关重要的,DNA碎片程度能够反映精子遗传物质的完整性,深入的评估男性生育力,预测治疗结局和指导治疗。目前常用的检测精子DNA碎片的方法主要有：精子染色质结构分析试验,单细胞凝胶电泳试验,末端转移酶介导的dUTP末端标记法,荧光原位杂交技术,8-羟基脱氧鸟苷测定等。然而这些方法大都需要流式细胞仪或荧光显微镜分析观察，或检测试剂昂贵或步骤繁琐，限制了这些方法的临床应用。

精子染色质扩散试验检测方法是利用正常精子经过酸处理去除核蛋白后,精子染色质结构松散,DNA环附于残留的核结构,形成光晕。精子染色质损伤处产生单链DNA片断,从而抑制了DNA光晕的扩散，根据光晕的大小可区分精子DNA损伤程度。

中国申请201410203476.5公开了一种精子DNA碎片检测试剂盒，所述试剂盒包括包被载玻片，易熔凝胶，A液，B液，瑞氏染液，瑞氏缓冲液，SCD保存液。该申请还公开了应用试剂盒对精子DNA碎片的检测方法。该申请所述SCD保存液，可以有效的保存精液标本，使DNA碎片率在-20℃冻存两个星期内不发生变化，利于标本保存；但其配方及其检测过程方法精子尾部显色效果不好，计数的准确率有待提高。

发明内容

本发明根据现有技术的不足公开了一种精子DNA碎片检测试剂盒及其检测方法。本发明要解决的问题是提供一种精子尾部显色效果更好，准确率更高，检测时间更短的用于精子DNA碎片检测试剂盒组成及其应用检测方法。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明首先提供了一种精子DNA碎片检测试剂盒，包括：

Ⅰ液：含0.04～0.08mol/L盐酸；

Ⅱ液：含7.305～146.1g/L氯化钠、1.86～37.2g/L乙二胺四乙酸、0.0607～1.214g/L三羟甲基氨基甲烷、0.5～20g/L十二烷基肌氨酸钠、1～20mL/L聚乙二醇辛基苯基醚、4.32～86.4mL/L3－巯基－1,2－丙二醇，溶液PH＝7～7.5；

0.5～2％琼脂糖包被的载玻片；

0.5～2％低熔点琼脂糖；

盖玻片；瑞氏染液；瑞氏缓冲液；

其中“％”表示重量百分比浓度。

上述试剂盒各组成制备方法如下：

一、Ⅰ液的制备方法：

1)取30～100mL纯水置1000mL容量瓶中，量取浓盐酸0.335～6.7mL，加入容量瓶中，搅拌混匀。

2)以纯水定容至1000mL，搅拌混匀。

二、Ⅱ液的制备方法：

1)取30～100mL纯水置1000mL容量瓶中，称取氯化钠7.305～146.1g、乙二胺四乙酸1.86～37.2g、三羟甲基氨基甲烷0.0607～1.214g、十二烷基肌氨酸钠0.5～20g，加入容量瓶中，搅拌使其溶解。

2)量取聚乙二醇辛基苯基醚1～20mL、3－巯基－1,2－丙二醇4.32～86.4mL，加入容量瓶中，搅拌使其溶解。

3)在PH检测下，缓慢加入氢氧化钠，调节PH至7～7.5。

4)以纯水定容至1000mL，搅拌混匀。

三、琼脂糖包被的载玻片制作方法：

1)取30～100mL纯水置1000mL容量瓶中，称取0.5～10g琼脂糖，50～60℃加热搅拌，使其溶解。

2)取纯水定容至1000mL，50～60℃加热搅拌，使其充分溶解。

3)趁热将2)中溶液至载玻片表面平铺，烤干。

四、低熔点琼脂糖的制作方法：

1)取30～100mL纯水置1000mL容量瓶中，称取0.5～10g琼脂糖，50～60℃加热搅拌，使其溶解。

2)取纯水定容至1000mL，50～60℃加热搅拌，使其充分溶解。

3)趁热将2)中溶液分装至1.5mL样品管中，每管0.12mL。

五、瑞氏染液及瑞氏缓冲液有市售。

本发明还提供了采用所述试剂盒进行精子DNA碎片的检测方法，包括以下步骤：

1)将低熔点琼脂糖加热充分溶解后，以60μL/管分装到1.5mL EP管内，4℃保存；

2)以生理盐水或PBS溶液将新鲜精液样本稀释为10～20×10⁶个/mL；

3)取60μL低熔点琼脂糖溶化，在37℃孵育3分钟；