[发明专利]一种精子DNA碎片检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于：

试剂盒包括：

Ⅰ液：含0.04～0.08mol/L盐酸；

Ⅱ液：含7.305～146.1g/L氯化钠、1.86～37.2g/L乙二胺四乙酸、0.0607～1.214g/L三羟甲基氨基甲烷、0.5～20g/L十二烷基肌氨酸钠、1～20mL/L聚乙二醇辛基苯基醚、4.32～86.4mL/L3－巯基－1,2－丙二醇，溶液PH=7～7.5；

0.5～2%琼脂糖包被的载玻片；

0.5～2%低熔点琼脂糖；

盖玻片；瑞氏染液；瑞氏缓冲液；

其中“%”表示重量百分比浓度。

2.根据权利要求1所述的精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于：

试剂盒包括：

Ⅰ液：含0.08mol/L盐酸；

Ⅱ液：含2.5mol/L氯化钠、0.1mol/L乙二胺四乙酸、10mmol/L三羟甲基氨基甲烷、2%十二烷基肌氨酸钠、2%聚乙二醇辛基苯基醚、0.8mol/L3－巯基－1,2－丙二醇，溶液PH=7～7.5；

1%琼脂糖包被的载玻片；

1%低熔点琼脂糖；

盖玻片；瑞氏染液；瑞氏缓冲液；

其中“%”表示重量百分比浓度。

3.一种权利要求1或2所述精子DNA碎片检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

Ⅰ液的制备方法：

1）取30～100mL纯水置1000mL容量瓶中，量取浓盐酸0.335～6.7mL，加入容量瓶中，搅拌混匀；

2）以纯水定容至1000mL，搅拌混匀；

Ⅱ液的制备方法：

1）取30～100mL纯水置1000mL容量瓶中，称取氯化钠7.305～146.1g、乙二胺四乙酸1.86～37.2g、三羟甲基氨基甲烷0.0607～1.214g、十二烷基肌氨酸钠0.5～20g，加入容量瓶中，搅拌使其溶解；

2）量取聚乙二醇辛基苯基醚1～20mL、3－巯基－1,2－丙二醇4.32～86.4mL，加入容量瓶中，搅拌使其溶解；

3）在PH检测下，缓慢加入氢氧化钠，调节PH至7～7.5；

4）以纯水定容至1000mL，搅拌混匀；

琼脂糖包被的载玻片制作方法：

1）取30～100mL纯水置1000mL容量瓶中，称取0.5～10g琼脂糖，50～60℃加热搅拌，使其溶解；

2）取纯水定容至1000mL，50～60℃加热搅拌，使其充分溶解；

3）趁热将2）中溶液至载玻片表面平铺，烤干；

低熔点琼脂糖的制作方法：

1）取30～100mL纯水置1000mL容量瓶中，称取0.5～10g琼脂糖，50～60℃加热搅拌，使其溶解；

2）取纯水定容至1000mL，50～60℃加热搅拌，使其充分溶解；

3）趁热将2）中溶液分装至1.5mL样品管中，每管0.12mL。

4.一种权利要求1或2所述精子DNA碎片检测试剂盒的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将低熔点琼脂糖加热充分溶解后，以60μL／管分装到1.5mL EP管内，4℃保存；

2）以生理盐水或PBS溶液将新鲜精液样本稀释至10～20×10⁶个/mL；

3）取60μL低熔点琼脂糖溶化，在37℃孵育3分钟；

4）步骤2）稀释后样本溶液30μL与步骤3）低熔点琼脂糖60μL混匀,37℃孵育2分钟；

5）取20μL步骤4）混合液滴于包被载玻片，并迅速盖上盖玻片，于4℃条件下静置5～7分钟，使其凝固；

6）取出步骤5）的玻片后小心移去盖玻片，立即将载玻片垂直浸入Ⅰ液反应池内7分钟；拭去载玻片背面多余液体后，将载玻片垂直浸入Ⅱ液反应池25分钟；拭去玻片背面多余液体后，置超纯水浸泡2～3分钟；

7）从步骤6）所述超纯水中取出后将载玻片分别依次置于50%乙醇溶液中2分钟,70%乙醇溶液中2分钟，95%乙醇溶液中2分钟，取出后自然晾干；

8）染片，每张载玻片以瑞氏染液4～6滴覆盖,稍等片刻再缓慢加入瑞氏缓冲液8～12滴,以洗耳球轻轻吹打混合染液,室温放置15分钟后用流水轻轻冲洗染片；

9）晾干后，普通光学显微镜下观察，镜下观察100～500个精子，计算存在DNA碎片的精子数量；

上述“%”表示重量百分比浓度；

精子DNA碎片率由下式得到：

精子DNA碎片率(%)=存在DNA碎片精子数／被观察精子总数×100%。