[发明专利]一种玉米中DON毒素产毒基因富集及检测的方法

权利要求书

1.一种玉米中DON毒素产毒基因富集及检测的方法，其特征在于，检测步骤包括：CTAB法提取总DNA；以所提DNA作为模板利用羧基磁性纳米颗粒对DON毒素产毒基因进行富集，再进行PCR扩增；PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测是否有目标条带从而确定所检测玉米中是否含有DON毒素产毒基因。

2.如权利要求1所述的玉米中DON毒素产毒基因富集及检测的方法，其特征在于，所述的检测方法具体步骤如下：

1)、总DNA的提取：

a.玉米样品15000-25000rpm粉碎1-5min；

b.取1-5g样品粉末于离心管中，加入CTAB提取缓冲液，60-70℃水浴15-25min；

c.冷却至室温，加入苯酚：氯仿：异戊醇，比例为25：24：1，10,000-20,000rpm离心10-20min,得到上清液1；

d.c步骤得到的上清液1加入1/10体积的10％CTAB-0.7M NaCl，再加入等体积的氯仿和异戊醇，氯仿和异戊醇的比例为24:1，10,000-20,000rpm离心10-20min，得到上清液2；

e.d步骤的上清液2加入等体积的冰冻异丙醇，3,000-5,000rpm离心10-20min，去上清，加入70％乙醇，其间换洗70％乙醇2-3次；

f.倒掉70％乙醇，风干后用适量TE缓冲液溶解DNA，-20℃保存；

2)、DON毒素产毒基因富集

a.羧基磁性纳米颗粒100-500μL，磁性指套分离，弃上清；

b.加入100-500μL活化缓冲液洗涤磁性纳米颗粒，磁性指套分离，重复2-3次，弃上清；

c.加入100-200μL EDC溶液和100-200μL NHS溶液于离心管中，漩涡混匀，20-30℃活化30-60min，磁性指套分离，弃上清；

d.加入10-50μL氨基引物和100-180μL PBS溶液(pH8.0)，轻柔混匀，20-30℃偶联1.5-2.5h，磁性指套分离，弃上清；

e.加入100-500μL封闭缓冲液，重悬磁性纳米颗粒，20-30℃反应1-2h封闭磁性纳米颗粒表面未反应的活化羧基基团，磁性指套分离，弃上清；

f.加入100-500μL PBS溶液(pH7.2)洗涤2-3次，磁性指套分离，弃上清；

g.加入150-200μL SSC溶液，30-50μL甲酰胺溶液和30-50μL单链玉米基因组DNA，室温杂交20-40min，磁性指套分离，弃上清；

h.加入100-500μL PBS溶液(pH7.2)洗涤2-3次，磁性指套分离，弃上清；

i.加入20-50μL双蒸水(ddH₂O)，94℃加热5min，上清液转移至另一离心管中-20℃保存；

3)、DON毒素产毒基因检测

a.PCR扩增体系：10×PCR Buffer2.5μL；Mg²⁺(10μM)2.5μL；dNTPs(2mM)2.5μL；DON毒素产毒基因引物上下游各0.5μL；DNA模板1.5μL；Taq酶5U/μL 0.3μL；ddH₂O 14.7μL。引物序列为：上游引物：

TACGTGAAACATTGTTGGC；下游引物：GGTGTCCCAGGATCTGCG；注：A为腺嘌呤；T为胸腺嘧啶；G为鸟嘌呤；C为胞嘧啶；

b.反应条件：

c.琼脂糖凝胶电泳：

PCR产物及核酸分子量参照物(DL 2000)，在1％琼脂糖凝胶上稳压120-130V，电泳20-30min；若样品中有脱氧雪腐镰刀烯醇(DON)则会有237bp扩增产物。

3.如权利要求2所述的一种玉米中DON毒素产毒基因富集及检测的方法，其特征在于，所述的总DNA提取方法中，第b步CTAB缓冲液的成分为：100mM Tris-HCl(pH8.0)，20mM EDTA-Na，1.4mM NaCl，2％CTAB，2％β-巯基乙醇。

4.如权利要求2所述的一种玉米中DON毒素产毒基因富集及检测的方法，其特征在于，所述的总DNA提取方法中，第d步10％CTAB-0.7M NaCl的成分为：4.1％NaCl，10％CTAB。