[发明专利]一种玉米中DON毒素产毒基因富集及检测的方法

说明书

技术领域

本发明涉及磁性纳米颗粒富集玉米中DON毒素产毒基因以及后续检测的方法，属于生物技术领域。

背景技术

禾谷镰刀菌是一种广泛分布于温暖潮湿地区的真菌，可以引起麦类作物的根腐、苗腐和穗腐，也能引起玉米的穗腐和茎基腐。禾谷镰刀菌侵染小麦，引起小麦的赤霉病，是我国东北麦区和长江流域最主要的病害，近年来还有扩大蔓延的趋势。在粮食储藏过程中，尤其是在夏季高温潮湿的环境中，禾谷镰刀菌生长速度快，毒素会随着菌体的生长不断的累积。毒素累积量超过国家标准后粮食就不能被人畜食用，失去商品价值，需要另作处理。因此会造成巨大的经济损失。种子带菌是禾谷镰刀菌侵染禾谷类作物的一种重要方式，播种染菌种子增加了禾谷类作物感染赤霉病的几率，这会对粮食产量产生直接影响。

禾谷镰刀菌不同菌株(不同采集地、寄主、感染部位)产生毒素的种类和能力有很大的差异。但主要有两大类：单端孢霉烯族毒素化合物(Trichothecenes)和玉米赤霉烯酮(ZEN)。

单端孢霉烯族毒素的基本结构为四环的倍半萜，其上的环氧集团是毒性的主要来源。根据特异功能基团的不同有A、B、C、D四种类型。A型和B型为天然污染的单端孢霉烯族毒素化合物。B型化合物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)与雪腐镰刀菌烯醇(NIV)为其主要两种毒素。单端孢霉烯族毒素化合物的急性中毒症状表现为呕吐、恶心、眩晕、便血、手足发麻等。慢性中毒有基因毒性、细胞毒性和免疫毒性。

目前检测粮食中DON毒素的方法主要有酶联免疫法和高效液相色谱法。酶联免疫法特异性强、灵敏度高，但酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒以及检测设备较昂贵。高效液相色谱法灵敏度高、可以定量检测样品中的毒素含量，但操作过程较繁琐需要专业人员操作，另外检测设备价格昂贵无法用于基层粮库中粮食的检测。使用磁珠对DON产毒基因进行富集再利用聚合酶链式反应(PCR)方法检测毒素基因的方法目前国内外还没有相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效简便的方法快速、简便地富集了玉米中的DON毒素产毒基因并对其进行检测。可以减少其他环境因素对DON毒素产毒基因提取的干扰，有效对其进行富集，以便后续的PCR检测。

一种玉米中DON毒素产毒基因富集及检测的方法，其特征在于，检测步骤包括：十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取总DNA；以所提DNA作为模板利用羧基磁性纳米颗粒对DON毒素产毒基因进行富集，再进行PCR扩增；PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测是否有目标条带从而确定所检测玉米中是否含有DON毒素产毒基因。

所述的检测方法，具体步骤如下：

1.总DNA的提取：

a.玉米样品15000-25000rpm粉碎1-5min。

b.取1-5g样品粉末于离心管中，适量CTAB提取缓冲液，60-70℃水浴15-25min；

c.冷却至室温，加入苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，10,000-20,000rpm离心10-20min，得到上清液1；

d.c步骤得到上清液1加入1/10体积的10％CTAB-0.7M NaCl，再加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，10,000-20,000rpm离心10-20min，得到上清液2；

e.d步骤得到上清液2上层水相加入等体积的冰冻异丙醇，3,000-5,000rpm离心10-20min，去上清，加入70％乙醇，其间换洗70％乙醇2-3次；

f.倒掉70％乙醇，风干后用适量三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(TE)缓冲液溶解DNA，-20℃保存。

2.DON毒素产毒基因富集

a.羧基磁性纳米颗粒100-500μL，磁性指套分离，弃上清；

b.加入100-500μL活化缓冲液洗涤磁性纳米颗粒，磁性指套分离，重复2-3次，弃上清；

c.加入100-200μL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液和100-200μL N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液于离心管中，漩涡混匀，20-30℃活化30-60min，磁性指套分离，弃上清；

d.加入10-50μL氨基引物和100-180μL磷酸盐缓冲液(PBS)溶液(pH 8.0)，轻柔混匀，20-30℃偶联1.5-2.5h，磁性指套分离，弃上清；

e.加入100-500μL封闭缓冲液，重悬磁性纳米颗粒，20-30℃反应1-2h封闭磁性纳米颗粒表面未反应的活化羧基基团，磁性指套分离，弃上清；