[发明专利]一种基于表面等离子体共振技术的核酸检测方法

说明书

技术领域

本发明属于核酸分析领域，具体涉及一种基于表面等离子体共振技术的核酸检测方法。

背景技术

癌症是死亡率第二高的疾病且死亡率仍在增加，而对此类疾病没有特效治疗药物，因此探索致癌基因早期检测的高灵敏核酸分析策略，尤其是针对低生理水平特定DNA/RNA序列的分析方法，显得非常必要。表面等离子体共振(SPR)技术是一种简单、直接的传感技术，是表面等离子体在金属和电介质的交界面上形成的一电荷层，在电磁波的激励下，表面等离子体发生共振现象。自80年代该技术首次运用于抗体与其抗原相互反应的测定后，已广泛应用于生物传感器领域并迅速渗透至基础生命科学研究中。该技术是一种基于质量变化的传感器，可方便灵活地应用于致癌基因的核酸检测。

现有的基于SPR核酸传感器，都是通过设计捕获探针直接和核酸杂交或利用纳米材料做标记来增强信号响应。如Homola课题组利用核酸分子直接增大SPR响应检测DNA，文献1：(Chemical Reviews.2008.108,462–493.)，这种方法可直接、适时地进行核酸检测；Corn研究团队设计的纳米金正方形的合结构增强SPR信号，文献2：(J.Am.Chem.Soc.2011,133,4271-4273.)，其响应信号有很大的提高且检测限低于飞摩尔级别；上述方法存在以下缺陷：

(1)核酸检测方法灵敏度低很难达到临床样品检测的要求，结构不够稳定重复性差，如文献1。

(2)纳米材料价格昂贵，合成需要特殊的设备，生物功能化困难且纳米金生产和纳米形貌控制复杂，制约其批量生产和应用，如文献2。

(3)在上述文献1和2的检测方法中，主要集中在以金属元素如金、银等合成特定形貌的纳米材料来增强SPR芯片金膜界面的位阻效应增强信号，易造成污染，且这些方法不具有通用性，因此难以广泛推广应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种简易、价廉的表面等离子体共振技术的信号放大技术，并将其应用于低浓度核酸的检测。

实现本发明目的的技术解决方案为：一种基于表面等离子体共振技术的核酸检测方法，包括如下步骤：

(1)先以EDC和NHS的缓冲液活化的羧基化的SPR芯片表面，再用缓冲液配制氨基末端的cDNA序列为5’-NH2-TCA GCG GGG AGG AAG GGA GTA AAG TTA ATA-3’溶液，将氨基末端的cDNA溶液加入SPR芯片表面，将cDNA以酰胺反应组装在SPR芯片表面，乙醇胺封闭界面作为传感界面对目标核酸的进行检测；

(2)加入目标DNA序列为5’-TCA GCG GGG AGG AAG GGA GTA AAG TTA ATA-3’缓冲液与传感界面进行杂交反应得到Au/cDNA/目标DNA组装层，实现对目标DNA的结合捕捉，完成检测步骤；

(3)用缓冲液分别配制序列为5’-CTT CCT CCC CGC TGA CAA AGT TCA GCG GGG-3’的颈环DNA H1溶液和序列为5’-TCA GCG GGG AGG AAG CCC CGC TGA ACT TTG-3’的颈环DNA H2溶液，溶液浓度均为5～10μM，将两种溶液混合后加热至90～95℃，维持5～10分钟，再迅速用冰水浴冷却至室温，即可完成杂交链循环反应形成长链dsDNA，将其与步骤2得到Au/cDNA/目标DNA组装层反应Au/cDNA/dsDNA组装层，在加入铁卟啉的缓冲液形成Au/cDNA/铁卟啉-dsDNA仿生催化剂；

(4)配制10～30mM 4-氯-1-萘酚乙醇溶液，再取1～2mL 4-氯-1-萘酚乙醇溶液与6～8mL缓冲液和2～5μL双氧水混合均匀作为信号放大液，加入步骤3得到的Au/cDNA/铁卟啉-dsDNA仿生催化剂表面进行氧化还原沉积反应，用SPR仪记录其信号响应。

其中，步骤(1)中所述的羧基化的SPR镀金片表面是通过10～30mM巯基丙酸(MPA)浸泡SPR芯片10～15小时。

步骤(1)中，所述的氨基末端的cDNA溶液的浓度为1～5μM；乙醇胺浓度为10～30mM。

步骤(2)中，所述的目标DNA缓冲液浓度为1～10⁵fM。

步骤(3)中，所述的铁卟啉为FeTMPyP。

步骤(1)、(2)、(3)和(4)中，采用的缓冲液均为磷酸缓冲液，其浓度为0.5～1M；pH为7.2～7.4；内含0.2～0.25M氯化钠。

本发明与现有技术相比，其显著优点是：