[发明专利]包含突变的核酸内切酶识别区DNA及其基因组编辑应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程与基因治疗领域，具体涉及一种通过突变基因组编辑核酸内切酶的靶向识别位点DNA序列，提高基因敲入效率并有效降低突变频率的方法，从而改善基因修饰细胞、动物模型的构建与人类疾病的基因治疗。

背景技术

基因组编辑(Genomeediting)是利用基因工程方法改造基因组上的特定序列,以实现特定的点突变(碱基修复)，序列敲除或敲入。近些年来，基因组编辑技术得到了长足的发展，并在很多领域大放异彩。目前，基因组编辑最主要的应用包括人类疾病的基因治疗和基础科学研究中的基因修饰细胞、动物模型的构建。

基因治疗是将外源正常基因或治疗性基因通过一定方式导入人体靶细胞，以达到纠正人体的原有缺陷基因或治疗疾病的治疗方法。对缺陷基因的纠正即可以通过在原位对缺陷基因进行修复，也可以通过在基因组其他位置引入正常基因或治疗性基因，实现对缺陷基因的功能增强或功能缺失。在传统的研究与医学实践中，基因治疗主要通过以下两种途径来实现：一、通过同源重组(Homologousrecombination)或基因打靶(Genetargeting)技术原位修复缺陷基因；二、通过整合的或非整合的途径将正确基因或治疗性基因片段导入靶细胞。传统的同源重组或基因打靶技术技术要求较高，同时效率低下。而通过将外源基因补充到基因组的方法，虽然能一定程度治疗疾病，但并未清除缺陷基因，同时外源基因随机整合会带来致癌等风险。高效精确地在缺陷基因原位进行修正或在特定基因位点引入治疗性基因是最理想的基因治疗模式，同时也是目前大家研究的热点。

基因治疗的最主要应用是治疗人类遗传病。遗传病是指遗传物质的改变(包括染色体畸变及基因突变)而导致的疾病。例如染色体数量异常导致的21三体综合征、多基因遗传病唇裂和HBB单基因突变导致的地中海贫血症等。由于医学的不断发展与进步，人类已经对多种遗传病的发生过程有了比较清楚的认识，并针对性地开发了多种治疗手段用于治疗或缓解病人的症状。例如，苯丙酮尿症和肝豆状核变性等遗传病会导致代谢阻碍或失衡，可通过改变饮食或服用药物予以纠正、缓解。然而，这些治疗手段往往治标不治本，要么效果有限，要么需终身防治。基因治疗是治疗遗传病的最彻底、最有效的方式。

除遗传病之外，其他一些人类疾病也可以通过基因治疗实现最彻底的治愈。例如，通过失活CCR5基因可以保护人类免疫系统免受艾滋病病毒的侵袭以防治传染病。通过向患者输入表达外源抗肿瘤基因的淋巴细胞可以杀死黑色素瘤等肿瘤细胞以治疗肿瘤。通过在造血干细胞中敲入基因工程改造的特异抗体基因以消除白血病或抗感染。目前，基因治疗大多都停留在实验室研究或动物实验上，尚未进行大规模的临床实践。

基础科学研究中的基因修饰细胞、动物模型的构建是基因组编辑的另一大应用。在基因功能研究中，携带特定基因修饰的细胞和动物模型是极其重要的实验材料。传统的制备方法包括：(1)首先制备携带预期突变或修饰的基因序列，通过质粒转染或病毒转导等途径随机整合到细胞基因组中，得到表达外源突变基因的细胞系或动物模型。(2)通过基因打靶技术在胚胎干细胞上对相应位点进行突变，得到基因突变胚胎干细胞或继而得到相应的基因突变动物。方法(1)由于随机整合，插入位点不一，表达模式跟原基因可能不一致。方法(2)可实现定点突变，且方法成熟，缺点是周期较长，技术要求比较高。

利用核酸内切酶定点靶向基因组(Endonuclease-mediatedgenomeediting，EMGE)的技术是近年来发展起来的一种高效基因组编辑技术，可以实现随机或者特定碱基的点突变，序列敲除或敲入。该技术利用基因组编辑核酸内切酶识别特异的基因组序列，其内切酶活性能造成识别序列内或者附近的基因组DNA双链断裂(Doublestrandbreak,DSB)，然后利用细胞中的DNA修复机制实现基因组编辑(包括定点突变，序列敲除或敲入)。