[发明专利]一种固定化单宁酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种固定化单宁酶的制备方法，属于酶的固定化及其应用领域。

背景技术

单宁酶（Tannase,E.C.3.1.1.20），是一种主要由微生物产生的诱导酶，以单宁酸、没食子酸等作为诱导物时可大量产生，属于细胞膜结合酶，可分泌到胞外。可水解没食子酰单宁、鞣花单宁及没食子酸烷基酯中的没食子酸酯键，生成没食子酸、葡萄糖及烷基醇等小分子物质。

工业制备没食子酸，多采用传统的浓硫酸法，即利用浓硫酸水解单宁酸生产没食子酸，这一方法虽然有效，但由于存在严重污染环境、水解副产物多、对设备腐蚀严重及耗能多等缺陷，因而这一方法已不能适应当前发展“节能环保”型产业的需求。而采用酶法转化，即利用单宁酶水解单宁酸生产没食子酸，不仅生产效率高，而且可避免浓硫酸法的缺陷，是一种对环境“绿色友好”的高效生物转化技术。

利用酶法生产没食子酸时，对于酶制剂形式的选择主要有以下三种：(i)游离酶。将单宁酶直接投入使用，方便、快捷。但游离酶无法回收，因而工艺成本较高。(ii)产酶菌体。将产单宁酶的菌体投入到单宁酸溶液中，通过发酵产酶，水解单宁酸。这一方法虽避免了单宁酶的分离提取及此过程对酶活的影响等缺陷，但菌体在发酵后趋于衰老，无法进行循环发酵产酶。(iii)固定化酶。将单宁酶固定于载体，利用固定化单宁酶水解单宁酸制备没食子酸。由于固定化酶可循环利用，且易分离，因而可大大提高生产效率，降低生产成本。但酶在固定化后，酶活通常会降低，同时，当固定化酶循环利用时，酶活亦不断随着使用次数的增加而不断下降。因此，寻找有效的固定化方法，最大可能的保持酶活力和提高固定化单宁酶的重复使用次数，降低固定化单宁酶生产成本，成为这一方法可否高效转化没食子酸并实现产业化的关键。

发明内容

本发明目的在于提供一种固定化单宁酶的制备方法，所得固定化单宁酶活力高、循环使用次数多，且生产成本低，可有效用于没食子酸的工业生产。

本发明的实施方案为：一种固定化单宁酶的制备方法，包括：

（1）先用无水乙醇振荡浸泡树脂1-3h,滤出树脂后再用丙酮振荡浸泡1-3h，把树脂滤出来后用蒸馏水振荡冲洗树脂至丙酮残留，备用；

（2）单宁酶粗酶液于4000-5000r/min离心10min，取上清液进行超滤浓缩，浓缩液为超滤酶液；

（3）将树脂浸于戊二醛水溶液中使树脂充分交联，滤出树脂后加入到含超滤酶液的PBS缓冲液中，室温下搅拌使树脂充分吸附酶，滤出固体颗粒即为固定化单宁酶，4℃保藏。

步骤（1）中，所述树脂为交链苯乙烯型非极性大孔吸附树脂，孔容为3mL/g，孔径为120?，比表面积为550m²/g。

步骤（2）中，所述超滤所用纤维膜的切割分子量（MWCO）为10-20kDa，上清液超滤后浓缩4-6倍。

步骤（3）中，所述戊二醛水溶液浓度为1%-5%（v/v），交联时间为2-6h。

步骤（3）中，所述PBS缓冲液浓度为0.01-0.1mol/L，超滤酶液与PBS缓冲液体积比为0.001-0.01。所述树脂投量和混合溶液的质量体积比为3%-6%（m/v），吸附时间为4-8h。

步骤（3）中，所述PBS缓冲液配制的配制方法为：先配制A液和B液。A液：称取7.16gNa₂HPO_4·12H₂O，蒸馏水定容于100mL，浓度为0.2mol/L，制得A液；称取3.12gNaH₂PO_4·2H₂O，蒸馏水定容于100mL，浓度为0.2mol/L，制得B液；取19mLA液和81mLB液混合，即得0.2mol/L的PBS缓冲液。通过稀释一定倍数，可得0.01-0.1mol/L的PBS缓冲液。

本发明提供的固定化单宁酶制备方法，工艺简单、成本低廉，同时，根据我们的酶活力测定方法，制备的固定化单宁酶活力高于游离单宁酶活力。另外，本方法制备的固定化单宁酶具有良好的保藏稳定性和重复利用性，可大大提高单宁酶的使用效率。

附图说明

图1为固定化单宁酶的保藏稳定性。纵坐标为酶活残留率（%），横坐标为保藏时间（d）。

图2为固定化单宁酶的重复使用次数。纵坐标为酶活残留率（%），横坐标为重复使用次数。

具体实施方式