[发明专利]一种结核分枝杆菌标准株H37Rv的DNA适配子及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种结核分枝杆菌标准株H₃₇Rv的DNA适配子及其制备方法。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis，MTB)感染引起的慢性传染性疾病，是国内外面临的严重的公共卫生问题，被列为我国重大传染病之一。结核病是历史上患病率和死亡率最高的疾病之一。2013年全球结核病感染患者约为900万，而因结核病死亡的人数达到150万；我国是全球结核病高负担国家之一，因此建立一种准确快速的检测结核分枝杆菌的方法对结核病早期诊断治疗有着重大意义。

目前，结核分枝杆菌的细菌学检测是结核病实验诊断的金标准。痰涂片直接镜检法是结核病实验室最基本的细菌学检查方法，其特点是简便、快速、价廉，但无法辨别死菌活菌；敏感性低，特异性差，各种抗酸杆菌均可着色。但仍具有实用性，对结核病早期诊断起到重要作用；目前国内外使用较多的细菌学检测方法如罗氏培养基时间较长、培养阳性率低。如今使用快速培养系统检测结核分枝杆菌虽能缩短培养时间、提高培养阳性率，但仍需4-6周，无法满足临床快速诊疗需求。分子生物学诊断虽然能满足速度快、特异性高、涂阳标本检出率高等要求。但其高成本，并且操作复杂，对实验条件和技术人员要求高，限制了其在临床检验中的普及应用。

当前结核病的诊断存在耗时长、灵敏度低等问题，探索快速简便的诊断方法一致是国内外学者研究的焦点。指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment，SELEX)是Ellington与Szostak(1990)最先报道使用，是一种新型体外筛选技术。该技术的基本原理是利用寡核苷酸分子可在空间形成多种多样的三维结构，通过构建的随机寡核苷酸文库，从中筛选出与目标靶分子有特异识别作用的高亲和力的寡核苷酸分子，再经扩增、反复筛选，使该类寡核苷酸分子得到富集，该富集的寡核苷酸分子称为适配子。与抗体蛋白相比，适配子具有分子识别能力强、稳定性高、制备简单、经济、快速等优点。该技术已成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、蛋白质、细胞，药物、氨基酸以及各种细胞因子等，可用于相应靶分子的检测识别。目前该技术在在人类病原微生物检测方面得到了广泛的应用。

已有研究通过SELEX技术筛选到相应靶物质的适配子作为拮抗剂，适用于肿瘤生长时的血管内皮生长因子、血栓生成因子、一些毒素蛋白和促生长因子等，已达到治疗目的。在微生物检测方面，特别是对一些未知的致病性细菌或病毒的研究，虽然不知道其内部结构、功能以及这些物质的表位，但将其作为靶物质，通过SELEX过程筛选到与其相对应的适配子，检测靶物质，已成为该领域的研究探索热点。

发明内容

为了解决上述现有技术中的问题，本发明提供了一种结核分枝杆菌标准株H₃₇Rv的DNA适配子及其制备方法。

为了实现本发明的目的，本发明的一种结核分枝杆菌标准株H₃₇Rv的ssDNA适配子，DNA适配子的核苷酸序列为：

5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAATATCCCTATTCCGCTCCATGTTGCGTACCCGTGCCTTCGACATGAGGCCCGGATC-3’

本发明的另一个目的是应用上述适配子于细菌学检测，尤其是检测临床菌株，菌株包括结核分枝杆菌(MTB)，非结核分枝杆菌(Non-Tuberculosis Mycobacteria，NTM)和非分枝杆菌。

本发明的还提供一种结核分枝杆菌检测试剂盒，试剂盒中包含有上述的DNA适配子。

另一方面，本发明还提供上述结核分枝杆菌标准株H₃₇Rv的DNA适配子的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，构建随机单链寡核苷酸文库：设计合成78碱基对的随机单链DNA文库：5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N₃₅-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’，其中N代表碱基AGCT中的任意一个，文库的容量为10¹⁴-10¹⁵，并进一步得到纯化的单链ssDNA文库用于结核分枝杆菌标准株H₃₇Rv适配子的SELEX技术筛选；