[发明专利]一种利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养及遗传转化，具体涉及一种利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法。

背景技术

玉米是世界三大粮食作物之一，也是现代食品工业、医药工业和化学工业的重要原料，它的遗传转化研究一直受到各国科学家的重视。现今主要采用的方法是以玉米幼胚为受体的农杆菌转化法，但是玉米为单子叶植物，不是农杆菌的天然宿主，因此农杆菌介导玉米转化难度较大。

经检索发现，公开号为CN103114106的发明专利申请公开了一种农杆菌侵染玉米幼胚的方法，在侵染过程中对玉米幼胚先进行热激处理，再进行农杆菌侵染和共培养，这样可以大大提高农杆菌的侵染效率。

公开号为CN102051377的发明专利申请公开了一种非组织培养的玉米遗传转化方法，包括(1)剥取玉米幼胚；(2)制备农杆菌菌液；(3)侵染与共培养；(4)转基因植株生长；(5)转基因植株的检测。

但是现有的遗传转化方法不能保证转化效率，且有农杆菌侵染过度导致的染菌问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种转化效率稳定、简单易行的利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法。

为达到上述目的，具体采用如下的技术方案：

一种利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法，具体包括如下步骤：

(1)制备农杆菌侵染液：取农杆菌菌斑溶于pH值为4.8～5.6的侵染液中，室温(19～25℃)慢摇3～4h，调OD₅₅₀为0.5～0.55，得农杆菌侵染液；

(2)侵染与共培养：用所述侵染液对玉米幼胚侵染，侵染液：玉米幼胚＝1mL：(100～150)个，侵染结束后去除侵染液，加入所述农杆菌侵染液，避光5～15min，侵染结束后，将幼胚盾面朝上，放入共培养培养基中，19～23℃暗培养1～4天。

在本发明的技术方案中，侵染液的组分如下：N6培养基1.99～3.98g/L，2,4-二氯苯氧乙酸1.0～1.5mg/L，脯氨酸0.5～0.7g/L，蔗糖68.4～75g/L，葡萄糖36～40g/L，2-吗啉乙磺酸0.3～0.5g/L，乙酰丁香酮100～150mM/L。

优选地，侵染液的组分如下：N6培养基1.99g/L，2,4-二氯苯氧乙酸1.5mg/L，脯氨酸0.7g/L，蔗糖68.4g/L，葡萄糖36g/L，2-吗啉乙磺酸0.5g/L，乙酰丁香酮100mM/L。

最优选地，当侵染液的pH值为5.2时，能够有效促进农杆菌活性，提高侵染效率。

更加具体的，侵染液的制备方法为：将N6培养基、2,4-二氯苯氧乙酸、脯氨酸、蔗糖、葡萄糖和2-吗啉乙磺酸加入蒸馏水中彻底溶解，调节pH值后，冷却至50℃，加入抽滤灭菌保存的乙酰丁香酮，之后搅拌均匀，倒入无菌培养皿中，40-50皿/L。本发明提供的侵染液的制备方法能够最大程度的保持各组分的活性，有利于提高侵染效率。

在本发明的步骤(2)中，所述共培养培养基的组分如下N6培养基1.99～3.98g/L，2,4-二氯苯氧乙酸1.0～1.5mg/L，脯氨酸0.5～0.7g/L，蔗糖30～35g/L，2-吗啉乙磺酸0.3～0.5g/L，植物凝胶3～4g/L，乙酰丁香酮100～150mM/L，硝酸银5～7mM/L，半胱氨酸盐酸盐300～400mg/L，pH值为5.8～6.0。

优选地，所述共培养培养基的组分如下：N6培养基1.99g/L，2,4-二氯苯氧乙酸1.5mg/L，脯氨酸0.7g/L，蔗糖30g/L，2-吗啉乙磺酸0.5g/L，植物凝胶3g/L，乙酰丁香酮100mM/L，硝酸银5mM/L，半胱氨酸盐酸盐400mg/L，pH值为5.8。当以此作为共培养培养基时，可防止在共培养过程中农杆菌过快繁殖，侵染过度，造成幼胚死亡。

更加具体的，共培养培养基的制备方法为：将N6培养基、2,4-二氯苯氧乙酸、脯氨酸、蔗糖、2-吗啉乙磺酸混合，定容至pH5.8～6.0后加入植物凝胶，然后高温高压灭菌(优选为121℃高温高压灭菌30min)，最后冷却至50-45℃加入抽滤灭菌的乙酰丁香酮、硝酸银、半胱氨酸盐酸盐，在磁力搅拌器上搅拌均匀，分装到无菌培养皿中即得。本发明提供的共培养培养基的制备方法保证了培养基各组分的活性不会丧失，浓度精确，无菌安全。

在本发明的技术方案中，当侵染结束后，优选将幼胚盾面朝上，放入共培养培养基中，19～23℃暗培养1～3天，更加优选在22℃培养3天，此时可以显著提高玉米幼胚的转化率。