[发明专利]一种利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法

权利要求书

1.一种利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备农杆菌侵染液：取农杆菌菌斑溶于pH值为4.8～5.6的侵染液中，室温慢摇3～4h，调OD₅₅₀为0.5～0.55，得农杆菌侵染液；

(2)侵染与共培养：用所述侵染液对玉米幼胚进行侵染，侵染液：玉米幼胚＝1mL：(100～150)个，侵染结束后去除侵染液，加入所述农杆菌侵染液，避光5～15min侵染，侵染结束后，将幼胚盾面朝上，放入共培养培养基中，19～23℃暗培养1～4天。

2.根据权利要求1所述的利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法，其特征在于，所述侵染液的组分如下：N6培养基1.99～3.98g/L，2,4-二氯苯氧乙酸1.0～1.5mg/L，脯氨酸0.5～0.7g/L，蔗糖68.4～75g/L，葡萄糖36～40g/L，2-吗啉乙磺酸0.3～0.5g/L，乙酰丁香酮100～150mM/L。

3.根据权利要求2所述的利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法，其特征在于，所述侵染液的组分如下：N6培养基1.99g/L，2,4-二氯苯氧乙酸1.5mg/L，脯氨酸0.7g/L，蔗糖68.4g/L，葡萄糖36g/L，2-吗啉乙磺酸0.5g/L，乙酰丁香酮100mM/L。

4.根据权利要求2或3所述的利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法，其特征在于，所述侵染液的pH值为5.2。

5.根据权利要求1-4任一项所述的利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法，其特征在于，所述共培养培养基的组分如下：N6培养基1.99～3.98g/L，2,4-二氯苯氧乙酸1.0～1.5mg/L，脯氨酸0.5～0.7g/L，蔗糖30～35g/L，2-吗啉乙磺酸0.3～0.5g/L，植物凝胶3～4g/L，乙酰丁香酮100～150mM/L，硝酸银5～7mM/L，半胱氨酸盐酸盐300～400mg/L，pH值为5.8～6.0。

6.根据权利要求5所述的利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法，其特征在于，所述共培养培养基的组分如下：N6培养基1.99g/L，2,4-二氯苯氧乙酸1.5mg/L，脯氨酸0.7g/L，蔗糖30g/L，2-吗啉乙磺酸0.5g/L，植物凝胶3g/L，乙酰丁香酮100mM/L，硝酸银5mM/L，半胱氨酸盐酸盐400mg/L，pH值为5.8。

7.根据权利要求1-4任一项所述的利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法，其特征在于，步骤(2)侵染结束后，将幼胚盾面朝上，放入共培养培养基中，22℃暗培养3天。

8.根据权利要求1-4任一项所述的利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法，其特征在于，步骤(1)所述农杆菌菌斑的制备方法为：用接种环挑取农杆菌菌株在农杆菌固体培养基画线，25～30℃暗培养2～3天，将农杆菌固体培养基保存在-80℃的环境中，每次挑取一个菌斑涂于农杆菌培养基固体培养基中，20～25℃暗培养2～4天后即可得到农杆菌菌斑。

9.根据权利要求8所述的利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法，其特征在于，所述农杆菌固体培养基的组分如下：蛋白胨10g/L，NaCl 15g/L，酵母提取物10g/L，琼脂15g/L，利福平50mg/L，壮观霉素50mg/L，卡那霉素50mg/L。

10.根据权利要求1所述的利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法，其特征在于，所述玉米幼胚的剥取方法为：选取自花授粉9～11天的幼穗，灭菌，在幼穗的窄端将镊子尖端插入幼穗中，使用手术刀片从窄端到宽端削掉幼粒1/3～2/3，用刀背在幼粒的宽端进刀，向窄端用力挑取幼胚。