[发明专利]一种植物根际木霉菌分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种木霉菌分离方法。

背景技术

木霉菌作为生物防治菌的优势在于对多种植物病原菌具有广谱的抗菌特性，比如可以防治可可黑荚病，葡萄孢疫病及西红柿和黄瓜枯萎病等多种真菌病害；不仅可以防治农作物及林木生长期病害还可防治采摘后的蔬菜水果及园艺花卉的材料储存期病害；同时还能刺激种子萌发、根的伸长、植物生长并且提早开花结实；改善土壤微生物群落结构及pH值，降低土壤盐碱度。兼具杀真菌生物农药与促生长生物肥料及土壤改良剂等多种功效。因此，从我国的农田生态系统(粮食、蔬菜和果树)和非农田生态系统(森林、草原和沙漠)中大规模采集木霉菌株，并明确不同生态系统的优势种及木霉菌多样性，筛选出生物防治，高效产抗生素，和具有耐受极端环境因子的木霉菌株具有重要的理论意义和应用价值。

但是，现有木霉菌的分离方法，普遍存在分离速度慢、效率低，优势木霉种得到分离，而低丰度木霉种往往被漏掉，因此，不能满足木霉菌多样性分析的需求，极大的制约了木霉菌资源收集进度，限制了木霉菌的应用。

发明内容

本发明目的是为了解决现有木霉菌分离存在分离速度慢、效率低，被分离的木霉菌多样性差的问题，从而提供一种植物根际木霉菌分离方法。

植物根际木霉菌分离方法，按以下步骤实现：

一、样品采集及处理：

采集：任意时间采集自然环境中的木本植物、草本植物、花卉、蔬菜或中草药的根系或根际土壤样品；

处理：浅根系的矮小植物：戴上灭菌的手套，除去根系上附着的土壤，利用灭菌的剪刀剪取100～200g根，装入灭菌的聚丙烯塑料袋中，获得根系样品；深根系的大型植物：取10～20cm深处100～200g根际土壤装入灭菌的聚丙烯塑料袋中，获得土壤样品；

二、超净工作台中，取30g根系样品或土壤样品放入装有100mL灭菌蒸馏水的三角瓶中，封上瓶盖，在140r/min的摇床中摇动10min，获得样品原液，然后制备5倍、25倍、50倍和75倍的稀释液；

三、样品原液及其稀释液分别吸取200μL，利用灭过菌的涂布涂在孟加拉红固体培养基表面，各涂布10皿，共计50皿，置于25℃的培养箱中培养24～48h，获得木霉菌落；

四、在超净工作台中，观察获得的木霉菌落，每种样品至少挑取20个木霉菌落，分别转接到PDA斜面培养基中，置于25℃的培养箱中培养5d，分离出木霉菌，获得纯培养物，即完成植物根际木霉菌分离；

其中步骤四中孟加拉红固体培养基是装有20mL孟加拉红固体培养基的9cm培养皿。

本发明中植物根际木霉菌分离方法的优点：

广谱：可在所有植物根系及根际土壤中分离出多种木霉菌，而现有的方法只能从植物根际分离到丰度较高木霉菌。

快速：木霉菌落可在24～48h内被获得；而现有方法至少需要五天的时间。

高效：单次分离20株以上，保证多样性鉴定的需求，而现有方法只能分离5～10株。

简单：本发明在24～48h内获得木霉菌落，任何其它真菌都没开始产孢，保证分离出的是单一的木霉菌株，免去单孢分离的步骤。

附图说明

图1为实施例中木霉属的形态图；

图2为实施例中木霉属的形态图；

图3为实施例中木霉属的形态图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式植物根际木霉菌分离方法，按以下步骤实现：

一、样品采集及处理：

采集：任意时间采集自然环境中的木本植物、草本植物、花卉、蔬菜或中草药的根系或根际土壤样品；

处理：浅根系的矮小植物：戴上灭菌的手套，除去根系上附着的土壤，利用灭菌的剪刀剪取100～200g根，装入灭菌的聚丙烯塑料袋中，获得根系样品；深根系的大型植物：取10～20cm深处100～200g根际土壤装入灭菌的聚丙烯塑料袋中，获得土壤样品；

二、超净工作台中，取30g根系样品或土壤样品放入装有100mL灭菌蒸馏水的三角瓶中，封上瓶盖，在140r/min的摇床中摇动10min，获得样品原液，然后制备5倍、25倍、50倍和75倍的稀释液；

三、样品原液及其稀释液分别吸取200μL，利用灭过菌的涂布涂在孟加拉红固体培养基表面，各涂布10皿，共计50皿，置于25℃的培养箱中培养24～48h，获得木霉菌落；