[发明专利]一种植物根际木霉菌分离方法

权利要求书

1.一种植物根际木霉分离方法，其特征在于它按以下步骤实现：

一、样品采集及处理：

采集：任意时间采集自然环境中的木本植物、草本植物、花卉、蔬菜或中草药的根系或根际土壤样品；

处理：浅根系的矮小植物：戴上灭菌的手套，除去根系上附着的土壤，利用灭菌的剪刀剪取100～200g根，装入灭菌的聚丙烯塑料袋中，获得根系样品；深根系的大型植物：取10～20cm深处100～200g根际土壤装入灭菌的聚丙烯塑料袋中，获得土壤样品；

二、超净工作台中，取30g根系样品或土壤样品放入装有100mL灭菌蒸馏水的三角瓶中，封上瓶盖，在140r/min的摇床中摇动10min，获得样品原液，然后制备5倍、25倍、50倍和75倍的稀释液；

三、样品原液及其稀释液分别吸取200μL，利用灭过菌的涂布涂在孟加拉红固体培养基表面，各涂布10皿，共计50皿，置于25℃的培养箱中培养24～48h，获得木霉菌落；

四、在超净工作台中，观察获得的木霉菌落，每种样品至少挑取20个木霉菌落，分别转接到PDA斜面培养基中，置于25℃的培养箱中培养5d，分离出木霉菌，获得纯培养物，即完成植物根际木霉菌分离；

其中步骤四中孟加拉红固体培养基是装有20mL孟加拉红固体培养基的9cm培养皿。

2.根据权利要求1所述的一种植物根际木霉菌分离方法，其特征在于所述步骤一中的根系样品或土壤样品，若近期进行分离，则于4℃保存，若近期不进行分离，则于-20℃下保存。

3.根据权利要求1所述的一种植物根际木霉菌分离方法，其特征在于所述步骤一中剪刀剪取150g根。

4.根据权利要求1所述的一种植物根际木霉菌分离方法，其特征在于所述步骤一中取15cm深处150g根际土壤装入灭菌的聚丙烯塑料袋中，获得土壤样品。

5.根据权利要求1所述的一种植物根际木霉菌分离方法，其特征在于所述步骤二中制备稀释液：取灭菌的1.5mL离心管，加入800μL灭菌蒸馏水和200μL样品原液，吸打混匀即为5倍稀释液；取灭菌的1.5mL离心管，加入800μL灭菌蒸馏水和200μL 5倍稀释液，吸打混匀即为25倍稀释液；取灭菌的1.5mL离心管，加入800μL灭菌蒸馏水和200μL 25倍稀释液，吸打混匀即为75倍稀释液。

6.根据权利要求1所述的一种植物根际木霉菌分离方法，其特征在于所述步骤三中培养24～48h，这期间每隔4h在光线明亮的地方仔细观察一次木霉菌落，当发现木霉菌落时，立即将其转接到PDA斜面培养基中。

7.根据权利要求1所述的一种植物根际木霉菌分离方法，其特征在于所述步骤三中置于25℃的培养箱中培养36h。

8.根据权利要求1所述的一种植物根际木霉菌分离方法，其特征在于所述步骤三中孟加拉红固体培养基由5g蛋白胨、10g葡萄糖、1g磷酸二氢钾、0.5g MgSO₄·7H₂O、100mL1/3000孟加拉红溶液、0.1g氯霉素、15～20g琼脂和1000mL蒸馏水组成。