[发明专利]一种基因工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种经基因工程构建的卡那链霉菌(StreptomyceskanamyceticusXN126)，其特征在于，所述卡那链霉菌的双脱氧酶基因kanJ失活或由kanJ基因编码的双脱氧酶失活。

2.根据权利要求1所述的卡那链霉菌，其特征在于，所述kanJ基因选自：

(1)具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的序列；

(2)与(1)中的序列同源的序列；

(3)在严格条件下与(1)或(2)中的序列杂交且编码双脱氧酶的序列；和/或

(4)核苷酸序列与(1)或(2)中的序列有85％以上的同一性且编码双脱氧酶的序列；

优选地，所述kanJ基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

3.根据权利要求1或2所述的卡那链霉菌，其特征在于，所述失活是通过选自基因敲除、基因置换、基因沉默、RNA干扰和点突变中的一种或多种方式实现的。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的卡那链霉菌，其特征在于，所述卡那链霉菌为卡那链霉菌XN126(StreptomyceskanamyceticusXN126)，其保藏编号为CGMCCNo.10860。

5.一种构建用于生产卡那霉素B及其衍生物的卡那链霉菌的方法，其特征在于，所述方法包括：通过基因工程方法使卡那链霉菌中的kanJ基因失活或由kanJ基因编码的双脱氧酶失活；

优选地，所述失活是通过选自基因敲除、基因置换、基因沉默、RNA干扰和点突变中的一种或多种方式实现的。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基因工程方法为通过框架内缺失来阻断卡那链霉菌中的kanJ基因。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述框架内缺失包括以下步骤：

(1)构建kanJ基因双交换阻断质粒；

(2)使用步骤(1)中构建的质粒转化卡那链霉菌，获得转化子；

(3)筛选步骤(2)中获得的转化子，获得双交换菌株。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括构建含大肠杆菌中的复制起始位点ori、接合转移起始位点oriT、大肠杆菌中的抗性筛选标记、链霉菌中的抗性筛选标记，kanJ的上下游同源片段(核苷酸序列命名为SEQIDNO:4)的kanJ基因双交换阻断质粒；

优选地，所述步骤(1)包括：

(1-1)以卡那链霉菌基因组DNA为模板，分别以SEQIDNO:5和SEQIDNO:6为上游引物，SEQIDNO:7和SEQIDNO:8为下游引物，进行PCR扩增；

(1-2)连接步骤(1-1)中分别得到的扩增片段，得到kanJ上游SEQIDNO:2所示的核苷酸序列和kanJ下游SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，然后上游序列用BamHI和EcoRI酶切下游序列用EcoRI和HindIII酶切，一起与经BamHI和HindIII酶切的pIJ2925连接，得到带有ΔkanJ(包括kanJ上游SEQIDNO:2所示的核苷酸序列和kanJ下游SEQIDNO:3所示的核苷酸序列)片段pIJ2925，命名为pDLJ201；

(1-3)以质粒pSET152为模版PCR扩增Am抗性基因和oriT位点，将得到的扩增片段连接到用EcoRI和KpnI酶切的质粒pIJ2925上，用T4连接酶连接环化；和

(1-4)用BamHI和HindIII酶切步骤(1-3)中得到的含Am抗性基因和oriT位点的pIJ2925，然后与步骤(1-2)中得到的经BamHI和HindIII酶切的pDLJ2925连接，获得kanJ基因双交换阻断质粒pDLJ202。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的转化是以大肠杆菌介导的接合转移方法；

优选地，所述步骤(2)包括：

(2-1)将步骤(1)得到的kanJ基因双交换阻断质粒转化大肠杆菌，筛选氯霉素、卡那霉素和安普霉素三抗菌株，获得用于基因阻断的供体菌；和

(2-2)将步骤(2-1)得到的供体菌和经热激与预培养的卡那链霉菌单孢子悬液混合培养，在安普霉素和萘啶酮酸存在下培养得到转化子。