[发明专利]一种制备构树体细胞胚的方法及其在构树扩繁中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种制备构树体细胞胚的方法及其在构树扩繁中的应用。

背景技术

构树又称楮树，Broussoneti Papyrifera(L)Vent，属桑科植物的落叶乔木，各种类型的土壤几乎都能生长，极少病虫害，耐干冷，耐湿热，根系发达，是保护生态环境和水土保持的一种优良树种。构树一年栽植，多年收获。构树全身都能利用：树皮纤维洁白、细长，是高档的造纸和纺织原料，价值高，市场需求量大；木杆是生产纸张、纤维板的好原料；树叶含有丰富的粗蛋白、氨基酸、微量元素，是动物的优质饲料原料。采用高密度栽培技术种植构树，亩产韧皮纤维200公斤，木杆1500公斤，优质饲料树叶1500公斤。由于构树具有绿化和其他经济价值，市场对于构树种苗的需求非常大，每年将达到2000万株。

目前构树的种苗制备主要靠扦插和组培苗供应。扦插存在着季节性、场地占用面积大、效率低等问题。常规组培方法存在着人工成本高、劳动量大、成本高等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备构树体细胞胚的方法及其在构树扩繁中的应用。

本发明提供了一种制备构树体细胞胚的方法(方法甲)，包括如下步骤：

(Ⅰ)取构树无菌苗的叶片，切成0.5×0.5cm²，接种到培养基甲上，23±2℃黑暗培养25天；

(Ⅱ)取步骤(Ⅰ)得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，23±2℃黑暗培养25天；

(Ⅲ)取步骤(Ⅱ)得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，23±2℃黑暗培养25天；

(Ⅳ)将1g步骤(Ⅲ)得到的胚性愈伤组织加至10ml培养基乙中，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；

(Ⅴ)完成步骤(Ⅳ)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；

(Ⅵ)完成步骤(Ⅴ)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；

(Ⅶ)完成步骤(Ⅵ)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；

(Ⅷ)完成步骤(Ⅶ)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；

(Ⅸ)将1体积份步骤(Ⅷ)得到的培养体系与2体积份培养基丙混合，23±2℃、12小时光照/12小时黑暗、100rpm振荡培养30天；

所述培养基甲为含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L琼脂粉的MS培养基；所述培养基乙为含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和30g/L蔗糖的1/2MS培养基；所述培养基丙为含0.5mg/L NAA、0.2mM TDZ、0.4mg/L IBA、0.4mg/L 6-BA和30g/L蔗糖的1/2MS培养基。

步骤(Ⅸ)中，所述光照的条件可为1500-2000lx，具体可为1500lx。

本发明还提供了另一种制备构树体细胞胚的方法(方法乙)，包括如下步骤：

(1)将构树的胚性愈伤组织加至培养基乙中进行培养；所述培养基乙为含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和30g/L蔗糖的1/2MS培养基；

(2)完成步骤(1)后，将培养体系转接至培养基丙中进行培养；所述培养基丙为含0.5mg/L NAA、0.2mM TDZ、0.4mg/L IBA、0.4mg/L 6-BA和30g/L蔗糖的1/2MS培养基。

方法乙中，所述构树的胚性愈伤组织的制备方法如下：取构树的外植体，接种到培养基甲上，进行培养；所述培养基甲为含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L琼脂粉的MS培养基。

方法乙中，所述构树的胚性愈伤组织的制备方法如下：

①取构树的外植体，接种到培养基甲上，培养；

②取步骤①得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，培养；

③取步骤②得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，培养；

所述培养基甲为含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L琼脂粉的MS培养基。

所述构树的外植体为构树无菌苗的叶或构树无菌苗的茎。所述构树的外植体具体如下：取构树无菌苗的叶片，切成0.5×0.5cm²。所述构树的外植体具体如下：取构树无菌苗的茎，切成1cm的茎段。