[发明专利]一种制备构树体细胞胚的方法及其在构树扩繁中的应用

权利要求书

1.一种制备构树体细胞胚的方法，包括如下步骤：

(Ⅰ)取构树无菌苗的叶片，切成0.5×0.5cm²，接种到培养基甲上，23±2℃黑暗培养25天；

(Ⅱ)取步骤(Ⅰ)得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，23±2℃黑暗培养25天；

(Ⅲ)取步骤(Ⅱ)得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，23±2℃黑暗培养25天；

(Ⅳ)将1g步骤(Ⅲ)得到的胚性愈伤组织加至10ml培养基乙中，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；

(Ⅴ)完成步骤(Ⅳ)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；

(Ⅵ)完成步骤(Ⅴ)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；

(Ⅶ)完成步骤(Ⅵ)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；

(Ⅷ)完成步骤(Ⅶ)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；

(Ⅸ)将1体积份步骤(Ⅷ)得到的培养体系与2体积份培养基丙混合，23±2℃、12小时光照/12小时黑暗、100rpm振荡培养30天；

所述培养基甲为含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L琼脂粉的MS培养基；所述培养基乙为含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和30g/L蔗糖的1/2MS培养基；所述培养基丙为含0.5mg/L NAA、0.2mM TDZ、0.4mg/L IBA、0.4mg/L 6-BA和30g/L蔗糖的1/2MS培养基。

步骤(Ⅸ)中，所述光照的条件可为1500-2000lx，具体可为1500lx。

2.一种制备构树体细胞胚的方法，包括如下步骤：

(1)将构树的胚性愈伤组织加至培养基乙中进行培养；所述培养基乙为含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和30g/L蔗糖的1/2MS培养基；

(2)完成步骤(1)后，将培养体系转接至培养基丙中进行培养；所述培养基丙为含0.5mg/L NAA、0.2mM TDZ、0.4mg/L IBA、0.4mg/L 6-BA和30g/L蔗糖的1/2MS培养基。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述构树的胚性愈伤组织的制备方法如下：取构树的外植体，接种到培养基甲上，进行培养；所述培养基甲为含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L琼脂粉的MS培养基。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述构树的胚性愈伤组织的制备方法如下：

①取构树的外植体，接种到培养基甲上，培养；

②取步骤①得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，培养；

③取步骤②得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，培养；

所述培养基甲为含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L琼脂粉的MS培养基。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述构树的外植体为构树无菌苗的叶或构树无菌苗的茎。

6.如权利要求2至5中任一所述的方法，其特征在于：

所述步骤(1)具体包括如下步骤：

(1-1)将1g构树的胚性愈伤组织加至10ml所述培养基乙中，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；

(1-2)完成步骤(1-1)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；

(1-3)完成步骤(1-2)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；

(1-4)完成步骤(1-3)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；

(1-5)完成步骤(1-4)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天。

7.如权利要求2至6中任一所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述培养的条件为：23±2℃、12小时光照/12小时黑暗、振荡培养30天。