[发明专利]一种冬虫夏草固体发酵液中多糖的提取方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种冬虫夏草固体发酵液中多糖的提取方法。

背景技术

冬虫夏草是麦角菌科真菌，它寄生于虫草蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体上。冬虫夏草首载于本草从新，味甘，性温，归肺，肾经，具有具有多种生理活性，如补虚损、益精气、保肺、益肾、止血化痰、滋补强壮、抗氧化、提高免疫力等，因此，常用来治疗劳咳痰血、盗汗、阳痿、遗精、黄胆病、肺结核及老年衰弱、慢性咳喘等症。一直以来，冬虫夏草一直被视为珍贵的中药材。

虫草多糖是虫草中含量最高的生物活性物质，具有抗肿瘤、抗氧化、提高免疫力、降低血脂等广泛的药理作用，目前，市面上的“金水宝胶囊”、“宁心宝胶囊”、“虫草菌胶囊”、“百令胶囊”等产品中起主要作用的就是虫草多糖。但由于冬虫夏草对生长环境要求较高，自然野生的产量相当有限，为此，如何对对冬虫夏草中的多糖活性成分进行高效提取，是目前国内外学者研究的热点。现有的冬虫夏草多糖提取技术主要包括超声波法、水提醇沉法及超临界二氧化碳萃取法，但上述方法存在各自的缺陷或不足，例如水提醇沉法提取率低，多糖纯度不足。为此，本发明提供一种改进的冬虫夏草胞内多糖提取方法。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中存在的上述问题，提供一种冬虫夏草固体发酵液中多糖的提取方法，多糖得率高，操作简便。

本发明的技术方案如下：

一种冬虫夏草固体发酵液中多糖的提取方法，包括以下步骤：

（1）样品前处理：将保藏好的冬虫夏草菌种5-10g经清水冲洗、烘干后，备用；

（2）配制固体发酵培养基：取葡萄糖2-5g，玉米粉2-4g，氮源1-2g，麦麸2-4g，KH₂PO₄2-4g,MgSO₄1-2g，VitaminB₁2-4g，VitaminB₂3-6g，培养基中加入蒸馏水，加热煮沸，调节PH，趁热倒入容器中，高压蒸汽灭菌，倒在平板上；

（3）发酵培养：将步骤（1）中经样品前处理后的样品接种到步骤（1）中制备好的培养基中，培养完成后取菌种发酵液备用；

（4）取步骤（3）中制得的菌种发酵液加水进行超声回流提取，经0.45um微孔滤膜过滤，取样品滤液备用；

（5）将步骤（4）中制备的样品滤液蒸发浓缩至原体积的1/3-1/2，再加乙醇进行醇沉，经过滤后，冷冻离心，取上清液在4℃条件下静置12h，在常温下离心，经0.45um微孔滤膜过滤得沉淀，采用无水乙醇洗涤1-3次，浓缩得到样品粗多糖；

（6）将步骤（5）中制得的样品粗多糖采用添加活性碳的沸水溶解脱色，冷却，再加沸水，再冷却，去除蛋白，将去除蛋白的样品溶液置入透析袋中，在蒸馏水中透析24h，将5-10倍体积的乙醇加入透析后的溶液中，在4℃条件下沉淀过夜，离心，弃上清，取沉淀物干燥，制得精多糖。

优选的，步骤（1）与步骤（6）中所述的烘干温度均为50-80℃。

优选的，步骤（2）中加蒸馏水的量是按料水比（1-3）:（1.5-5）的体积加入的。

优选的，步骤（2）中调节PH为调节PH至6.5-7.2。

优选的，步骤（2）中所述的高压蒸汽灭菌时间为10-20min。

优选的，步骤（3）中所述的培养温度为25-28℃，培养为无光照培养，培养时间为5-7d。

优选的，步骤（4）中所述的超声回流提取温度为80-100℃，提取时间为每次1-2h，提取次数为3-5次。

优选的，步骤（5）中所述的冷冻离心温度为-10--4℃，步骤（5）中两次离心及步骤（6）中的离心速度均为4000-8000r/min，离心时间均为10-20min。

优选的，步骤（6）中所述的添加活性碳的沸水中，活性碳的质量浓度为1-3%。

优选的，步骤（6）中所述的透析膜为截留分子量为6000-8000的半透膜，所述的乙醇浓度为65-80%。

本发明与现有技术相比，有益效果体现在：

1.氮源是虫草菌生长所必需的营养元素，由于虫草菌在原寄主蝙蝠蛾幼虫体内长期寄生，已适应对动物类蛋白的吸收利用，而对植物类蛋白吸收较差，导致其有效成分的含量及生物量低于动物氮源。因此，本发明中将蛋白胨或蚕蛹粉等作为固态培养基的氮源，可提高虫草菌丝体及其主要有效成分的含量