[发明专利]一种Aβ1-42单体及其制备、鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及β-淀粉样蛋白领域，具体涉及一种Aβ1-42单体及其制备、鉴定方法。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’S disease，AD)也称为老年痴呆症，是发生在老年期或老年前期的一种慢性、持续性、退化性的脑变性疾病，其临床表现为记忆减退、认知障碍、人格改变等。该病的病理特征主要包括大脑皮质和海马区域的细胞外出现以β-淀粉样蛋白(beta-amyloid,Aβ)为核心的老年斑、细胞内神经原纤维缠结等病变。在美国AD是仅次于心血管病、癌症和脑卒中的第四大死亡杀手，据统计目前全世界AD发病人数高达2500万，我国AD患者已达到600余万，居世界首位，AD病程时间长且目前尚无彻底根治的药物，它严重威胁着人类的健康，给患者及家属带来巨大的影响。因此建立理想及可靠的AD动物模型，对于研究和探讨AD的病因、病理过程以及寻找和筛选有效药物显得尤为重要。

Aβ是由淀粉样前体蛋白经β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用而产生的含有39～43个氨基酸的多肽，Aβ的大量沉积，是导致AD病人脑内老年斑周边神经元变性和死亡的主要原因。Aβ在脑内有多种存在形式，如：低分子量Aβ单体、Aβ寡聚体、不溶性Aβ纤维体等。Aβ单体是可溶性的低分子物质，但是当胞内环境，如pH、温度、离子浓度、蛋白浓度等改变时会诱发Aβ单体快速聚集，形成二聚体、三聚体或可溶性的Aβ寡聚体，Aβ寡聚体的稳定性较差，易向Aβ纤维体转化。Aβ的种类分为Aβ1-39、Aβ1-40、Aβ1-41、Aβ1-42和Aβ1-43，其中Aβ1-42的毒性最大，是AD的主要致病因素，因此，研究Aβ1-42是当前的热点。

近年来，有科学家提出，Aβ纤维体与记忆损害及神经细胞缺乏的关系不大，推测Aβ寡聚体、低分子量Aβ单体等可溶性Aβ可能是AD的致病因素。科学家们对Aβ1-42寡聚体做了很多研究，在建立模型时一般普遍采用Aβ1-42寡聚体直接注射方法，但目前制备、合成Aβ1-42的寡聚体均不稳定，体外容易随机形成各种高分子量或低分子量的混合产物，这种组分不均一的复杂混合物直接影响到实验结果的准确性和可靠性，造成无法区分是Aβ1-42寡聚体(oligomers)抑或是Aβ1-42寡聚体与单体(Monomers)的共同作用。但现有技术对Aβ1-42单体极少有报导，因此，制备成分较单一、稳定的Aβ1-42单体，可为AD的发病机制、病理过程、寻找和筛选有效药物提供有效依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新合成的Aβ1-42单体及其制备、鉴定方法。本发明提供的Aβ1-42单体成分较单一、产物较稳定，在建立动物模型时，能将Aβ1-42单体作为对照组或实验组，从而对模型的评价更为客观与科学，为建立理想和可靠的AD模型提供良好的基础；其制备方法简单、收率高、省时；所采用的SDS-PAGE结合蛋白免疫印记鉴定方法，具有敏度高、特异性强、方便快速、操作简单、费用较低等优点。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种Aβ1-42单体，所述的Aβ1-42单体主要为单体和少量寡聚体的混合物；所述单体经蛋白免疫印记法电泳鉴定：分子量为4-4.5KD；所述寡聚体经蛋白免疫印记法电泳鉴定：分子量为12-16KD，为三聚体和四聚体。

以上所述Aβ1-42单体，所述的Aβ1-42单体的制备方法为：取Aβ1-42合成肽，在室温下完全溶解在HFIP中，所得溶液转移到离心管中，用干浴氮吹仪使HFIP彻底吹干；加入DMSO使离心管底部的固体完全溶解，再加入HEPES缓冲液，混匀；在温度为37℃条件下震荡24小时，转速600转/分钟，即得。

以上所述Aβ1-42单体的制备方法，包括以下步骤：

1.将1mg的Aβ1-42合成肽，加入220-225μL HFIP中，在室温下静置30-60分钟，得到完全溶解的溶液；

2.将步骤1得到的溶液转移到硅化的离心管中，在干浴氮吹仪上吹8-15分钟，使HFIP彻底吹干，得到透明片状固体沉于管底；

3.在所述离心管中加入40μl DMSO，使离心管底部的固体完全溶解，再加入pH值为7.4的浓度为l0mM HEPES缓冲溶液，使溶液最后终体积为1ml，混合均匀；

4.将步骤3得到的溶液在温度为37℃条件下震荡24小时，转速600转/分钟，即得。

一种以上所述Aβ1-42单体的鉴定方法，包括以下步骤：