[发明专利]一种Aβ1-42单体及其制备、鉴定方法

权利要求书

1.一种Aβ1-42单体，其特征在于：所述的Aβ1-42单体主要为单体和少量寡聚体的混合物；

所述单体经蛋白免疫印记法电泳鉴定：分子量为4-4.5KD；

所述寡聚体经蛋白免疫印记法电泳鉴定：分子量为12-16KD，为三聚体和四聚体。

2.根据权利要求1所述Aβ1-42单体，其特征在于，所述的Aβ1-42单体的制备方法为：取Aβ1-42合成肽，在室温下完全溶解在HFIP中，所得溶液转移到离心管中，用干浴氮吹仪使HFIP彻底吹干；加入DMSO使离心管底部的固体完全溶解，再加入HEPES缓冲液，混匀；在温度为37℃条件下震荡24小时，转速600转/分钟，即得。

3.一种如权利要求1或2所述Aβ1-42单体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将1mg的Aβ1-42合成肽，加入220-225μL HFIP中，在室温下静置30-60分钟，得到完全溶解的溶液；

（2）将步骤（1）得到的溶液转移到硅化的离心管中，在干浴氮吹仪上吹8-15分钟，使HFIP彻底吹干，得到透明片状固体沉于管底；

（3）在所述离心管中加入40μl DMSO，使离心管底部的固体完全溶解，再加入pH值为7.4的浓度为l0mM HEPES缓冲溶液，使溶液最后终体积为1ml，混合均匀；

（4）将步骤（3）得到的溶液在温度为37℃条件下震荡24小时，转速600转/分钟，即得。

4.一种如权利要求1或2所述Aβ1-42单体的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳：取Aβ1-42单体溶液2μL，与18μL 4X电泳上样缓冲液混合均匀，然后上样，电泳上样量为5ul/泳道，电泳用的胶为4–12%的梯度胶，同时在一个泳道加入10μL分子量为3.6-260KD的预染分子量标准品，电泳时选择80V电压电泳30-40分钟,然后转100v电压继续电泳2小时；

（2）转膜：将电泳好的蛋白条带转移到PVDF膜上，半干法转膜，时间为6分钟,将转好的PVDF膜按加样泳道的大小裁剪，然后将剪裁好PVDF膜浸泡到TBST溶液中5-10分钟；

（3）封闭：再将PVDF膜浸泡在含有5%脱脂奶粉的TBST溶液中，摇床上慢速振荡，室温条件下封闭1小时；

(4)洗膜：将步骤（3）得到的PVDF膜浸泡在TBST溶液中，在摇床上震荡漂洗2-3次，每次5分钟；

(5)一抗孵育：将步骤（4）得到的PVDF膜浸泡在含有6E10的一抗溶液中，室温下孵育1小时；

(6)洗一抗膜：将经过一抗孵育的PVDF膜浸泡在TBST溶液中，在摇床上震荡漂洗6次，每次5分钟；

(7)二抗孵育：将漂洗好的PVDF膜浸泡在含有辣根过氧化物酶标记的二抗溶液中室温下孵育1小时；

(8)洗二抗膜：将经过二抗孵育的PVDF膜浸泡在TBST溶液中，在摇床上震荡漂洗6次，每次5分钟；

(9)化学发光曝光：将HRP底物液均匀加在经步骤（8）漂洗过的PVDF膜上，在5-30秒内分别进行暗室曝光显影，从中选择条带清晰的胶片作为最后结果。