[发明专利]基于LAMP实时荧光法的猪等孢球虫卵囊检测方法及其引物

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于LAMP实时荧光法的猪等孢球虫卵囊检测方法及其引物，是一种利用环介导等温扩增技术结合荧光定量PCR仪，进行粪便中猪等孢球虫卵囊快速检测的方法。

背景技术

猪球虫病主要是由寄生于空肠与回肠的猪等孢球虫(Isospora suis)引起，三周龄以内的哺乳仔猪感染后可出现腹泻和体重下降等临床症状。母猪对猪球虫病的传播影响不大，临床中很少检测到球虫卵囊，被猪等孢球虫卵囊污染的产房是一代仔猪传给下一代仔猪的主要途径。猪场环境、临床用药、管理水平与猪球虫病显著相关，非特异性免疫系统对抗球虫病有重要作用。在试验条件下，100％的相对湿度和25℃气温是等孢球虫卵囊发育和存活的最佳条件。自然条件下，猪等孢球虫卵囊在体外完成孢子化过程，孢子化的卵囊具有感染宿主的能力，常给养殖户的经济利益带来巨大的损害。近几年来，随着猪场规模的不断扩大和养殖管理水平的不断提高，人们越来越重视对仔猪球虫病的预防和治疗。

常见的检测猪等孢球虫的方法是采用传统显微镜检测粪便中的卵囊，但是，由于球虫个体微小，粪便中杂质较多，给检测带来一定的困难。除了显微镜检测外，目前还有ELISA检测法、自体荧光显微镜检测技术、PCR技术以及基于PCR原理的巢式PCR和PCR-RFLP等方法。这些方法与传统的显微镜检查方法相比，检测结果较为准确，但操作步骤繁多，检测时间耗时较长，检测的敏感性也存在不足。

环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,英文缩写LAMP)与普通PCR相比，其优势在于恒温即可进行核酸扩增，不需要经过热循环的温度变化。LAMP技术和PCR技术在反应温度、反应时间、产物量、引物特异性、引物级别、聚合酶类型、检测方法、检测成本等方面均有差异，PCR方法检测成本较低，但敏感性和特异性也低于LAMP技术，具体差异如下表：

LAMP技术与PCR技术的比较 

发明内容

本发明的目的在于针对目前检测猪等孢球虫的方法存在操作繁琐、敏感性较低等不足，提供一种简单、方便、快速的基于LAMP实时荧光法的猪等孢球虫卵囊检测方法及其引物。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

检测猪等孢球虫卵囊的引物，所述引物是利用GenBank收集的猪等孢球虫18S rRNA基因全序列设计的引物，所述引物如下：

上游外引物F3：5'-ATAGGATCAGGACCTCGTG-3'；

下游外引物B3：5'-GGCATTCCTCGTTGAAGAT-3'；

上游内引物FIP(F1c-F2)：

5'-CGTGCAGCCCAGAACATCTGTGTCTAACGCAAGGAAGT-3'；

下游内引物BIP(B1c-B2)：

5'-ACACTGATGCATCCAACGAGTTTCACGATGCATACTCACAAG-3'；

上游环引物LoopF：5'-TCACAGACCTGTTATTGCCTC-3'；

下游环引物LoopB：5'-TGGCCGATAGGTCTAGGTAAT-3'。

采用上述引物，基于LAMP实时荧光法的猪等孢球虫卵囊检测方法，包括以下步骤

1)猪等孢球虫卵囊的收集与纯化

采集新鲜的仔猪粪样，用饱和盐水漂浮法对卵囊进行收集，采用Sheather氏蔗糖 溶液梯度离心法对收集的卵囊进行纯化，具体操作方法是：取含猪等孢球虫卵囊的粪便溶于9-10倍体积清水中，依次经80目和120目筛过滤，然后2000-2500rpm离心2-3min，弃上清，加入沉淀9-10倍体积的饱和盐水，3000-3500rpm离心2-3min，取上清液并加入上清液5-6倍体积的浓度2.5％的重铬酸钾溶液，即为收集的卵囊液；

取收集的卵囊液进行1:1Sheather氏蔗糖溶液梯度离心，4000-4500rpm离心15-20min，然后取卵囊层和1/3左右蔗糖溶液上清，加入其5-6倍水稀释后，进行1:2Sheather氏蔗糖溶液梯度离心，4000-4500rpm离心15-20min，收集上层卵囊液，即为纯化后的卵囊液；

其中，所述1:1Sheather氏蔗糖溶液是指卵囊液和Sheather氏蔗糖溶液的体积比为1:1；所述1:2Sheather氏蔗糖溶液是指卵囊液和Sheather氏蔗糖溶液的体积比为1:2；