[发明专利]基于LAMP实时荧光法的猪等孢球虫卵囊检测方法及其引物

权利要求书

1.检测猪等孢球虫卵囊的引物，其特征在于：所述引物如下：

上游外引物F3：5'-ATAGGATCAGGACCTCGTG-3'；

下游外引物B3：5'-GGCATTCCTCGTTGAAGAT-3'；

上游内引物FIP(F1c-F2)：

5'-CGTGCAGCCCAGAACATCTGTGTCTAACGCAAGGAAGT-3'；

下游内引物BIP(B1c-B2)：

5'-ACACTGATGCATCCAACGAGTTTCACGATGCATACTCACAAG-3'；

上游环引物LoopF：5'-TCACAGACCTGTTATTGCCTC-3'；

下游环引物LoopB：5'-TGGCCGATAGGTCTAGGTAAT-3'。

2.采用权利要求1所述的引物基于LAMP实时荧光法的猪等孢球虫卵囊检测方法，其特征在于：其包括以下步骤

1)猪等孢球虫卵囊的收集与纯化

采集新鲜的仔猪粪样，用饱和盐水漂浮法对卵囊进行收集，采用Sheather氏蔗糖溶液梯度离心法对收集的卵囊进行纯化，具体操作方法是：取含猪等孢球虫卵囊的粪便溶于9-10倍体积水中，依次经80目和120目筛过滤后，然后2000-2500rpm离心2-3min，弃上清，加入沉淀9-10倍体积的饱和盐水，3000-3500rpm离心2-3min，取上清液并加入上清液5-6倍体积的浓度2.5％的重铬酸钾溶液，即为收集的卵囊液；

取收集的卵囊液进行1:1Sheather氏蔗糖溶液梯度离心，4000-4500rpm离心15-20min，然后取卵囊层和1/3蔗糖溶液上清，加入其5-6倍水稀释后，进行1:2Sheather氏蔗糖溶液梯度离心，4000-4500rpm离心15-20min，收集上层卵囊液，即为纯化后的卵囊液；

其中，所述1:1Sheather氏蔗糖溶液是指卵囊液和Sheather氏蔗糖溶液的体积比为1:1；所述1:2Sheather氏蔗糖溶液是指卵囊液和Sheather氏蔗糖溶液的体积比为1:2；

2)猪等孢球虫卵囊DNA的提取

采用粪便基因组DNA快速提取试剂盒，按照试剂盒的操作说明，从上述纯化后的卵囊液中提取猪等孢球虫卵囊的DNA，置-20℃冰箱保存；

3)目的基因的LAMP扩增：

采用权利要求1所述的引物进行LAMP反应，通过实时荧光定量PCR仪对LAMP反应的过程进行实时荧光信号的采集并监测；

反应体系根据DNA扩增试剂盒配制，所述反应系具体如下：

反应液RM(2×)12.5μL；

Bst聚合酶1.0μL；

荧光染料Ⅰ0.5μL；

DNA模板1-100ng；

上下游内引物的终浓度0.4-1.6μM；

上下游外引物的终浓度0.1-0.2μM；

上下游环引物的终浓度0.1-0.8μM；

补充超纯水至反应总体系为25μL，其中，所述DNA模板是指步骤2)提取的猪等孢球虫卵囊的DNA模板。

3.根据权利要求2所述的基于LAMP实时荧光法的猪等孢球虫卵囊检测方法，其特征在于：步骤3)所述的反应条件是63℃反应1h，每隔60s用FAM通道检测一次荧光信号，以0.2℃/s的增量从63℃升温至95℃并采集荧光信号分析熔解曲线。

4.根据权利要求2所述的基于LAMP实时荧光法的猪等孢球虫卵囊检测方法，其特征在于：步骤2)的具体操作方法如下：具体操作方法如下：取纯化后的卵囊液200μL于液氮和37℃水浴锅中反复冻融5次，每次1min；然后加入10μL的蛋白酶K和50μL溶菌酶，涡漩混匀1min，37℃水浴15min，期间每隔2-3min剧烈震荡混匀；然后加入100μL的DNA提取液，涡漩混匀1min，65℃水浴10min，期间每隔2-3min剧烈震荡混匀；10000rpm离心10min，取上清至新的1.5mL离心管，加入约为上清的1/3体积蛋白沉淀液，混匀；冰浴8min，13000rpm离心10min，将上清置于处理后的纯化柱，4000rpm离心3min；将虑液置于新的离心管中，并与滤液0.6倍体积的异丙醇震荡混匀，13000rpm离心10min，倒扣离心管2min；70％乙醇洗涤沉淀，30μL洗脱缓冲液EB溶解沉淀，将提取的猪等孢球虫卵囊DNA置-20℃冰箱保存。