[发明专利]一种快速鉴定茶树种质乌龙茶适制性的分子标记方法

说明书

技术领域

本发明属于茶树种质鉴定利用与品种选育领域。具体涉及一种快速鉴定茶树种质乌龙茶适制性的分子标记方法。

背景技术

简单重复序列（simple sequence repeat，SSR），具有等位变异高、共显性、简便、快速、稳定的特点，目前SSR是茶树种质鉴定、遗传多样性、亲缘关系等研究的主要分子标记之一。从NCBI公共数据库中下载茶树EST序列，利用软件获取EST序列微卫星（SSR）信息，并利用软件将微卫星侧翼保守序列设计成引物，通过初步筛选获得30对有效SSR引物，另收集公开发表的茶树SSR引物328对(Jian-Qiang Ma,Ming-Zhe Yao,Chun-Lei Ma,etc.Construction of a SSR-Based Genetic Map and Identification of QTLs for Catechins Content in Tea Plant(Camellia sinensis).Plos one 9(3): e93131. doi:10.1371/journal.pone.0093131)。

适制乌龙茶的茶树种质主要分布在我国福建、广东、台湾等地（黄福平,梁月荣,陆建良,等.乌龙茶种质资源种群遗传多样性AFLP评价.茶叶科学,2004,24(3):183-189)，按照上述步骤（1）至步骤（4）获得福建以及部分广东、台湾60个茶树种质合计358个位点上的基因型（上述358对SSR引物)。在TM352、TM445位点上这些种质均共包括8种基因型，且呈现规律性的分型特点，4种基因型为适制乌龙茶的茶树种质，其余4种基因型均为不适制乌龙茶的茶树种质，推测TM352、TM445位点与控制茶树种质乌龙茶适制性的基因（quantitative trait locus,QTL）连锁或共分离。

乌龙茶有别于其他茶类的最主要特征是具有自然幽雅的花香，形成这种品质特征的基础是茶树品种。乌龙茶产业的发展，在很大程度上取决于适制乌龙茶的茶树品种的选育与应用，而选育适制乌龙茶的茶树品种，其关键技术是对茶树种质进行乌龙茶适制性鉴定。对茶树种质进行乌龙茶适制性鉴定，至今仍采用直接鉴定法。该方法通过采摘茶树鲜叶加工制做乌龙茶样品，然后对样品进行感官审评确定品质，最后根据品质鉴定结果确定茶树种质乌龙茶适制性。直接鉴定法先要种植茶树种质，一般需要经过2～3年的扩繁与生长，才可进行单株或株系采制试验，品质鉴定需要重复3年。从茶树种植至获得品质鉴定结果至少需要5～6年。直接鉴定法存在鉴定时间长，耗费人力、物力、财力较大，鉴定效率较低等缺点。

将TM352、TM445位点上的4种基因型作为适制乌龙茶的茶树种质的基因型（图1，A、B、C、D；图2，a、b、c、d），可对茶树种质进行乌龙茶适制性快速鉴定。应用这种方法可在茶树生长的幼龄期（苗期）采摘微量的茶树组织（1～2g）进行分子标记基因型鉴定，通过简单的实验操作和分析即可筛选出适制乌龙茶的茶树种质，整个过程仅需要1-2个工作日即可，相比直接鉴定法（5～6年）极大的缩短了鉴定周期，可以减少乌龙茶品种选育过程人力、物力、财力的浪费。应用本方法进行分子标记辅助选择育种（Molecular Marker-Assisted Selection,MAS），可以一定程度上实现乌龙茶品种定向育种，减少乌龙茶新品种选育的盲目性。应用本方法还可以初步掌握多个待鉴定茶树种质间的遗传背景与亲缘关系。该方法可作为快速鉴定茶树种质乌龙茶适制性的分子标记方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速鉴定茶树种质乌龙茶适制性的分子标记方法，可在茶树生长的幼龄期（苗期）快速鉴定茶树种质的乌龙茶适制性，减少乌龙茶品种选育过程人力、物力、财力的浪费。在一定程度上实现乌龙茶定向育种，减少乌龙茶新品种选育的盲目性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

包含以下具体步骤：

（1）待鉴定茶树种质基因组DNA提取

将研钵中加入3mL1.5%CTAB溶液，取2.0g样品放到研钵中研磨均匀，吸取1.0mL研磨溶液转入2.0mL离心管中，置65℃水浴1h，间隔15min轻轻混匀1次。

冷却后，加入600uL的氯仿：异戊醇，其体积比为24:1，混匀，12000r/min，离心15min。

吸上清，转入新的1.5mL离心管，重复步骤1次。

吸上清，转入新的离心管中，加入1/3体积的3mol/L NaAc和1mL-20℃预冷的无水乙醇，混匀后置于-20℃静置30min。