[发明专利]一种快速鉴定茶树种质乌龙茶适制性的分子标记方法

权利要求书

1.一种快速鉴定茶树种质乌龙茶适制性的分子标记方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

（1）待鉴定茶树种质基因组DNA提取；

（2）特定的SSR荧光标记引物合成；

（3）以待鉴定茶树种质基因组DNA为模板，分别利用特定的SSR荧光标记引物进行PCR扩增；

（4）PCR扩增产物检测，分别获得待鉴定茶树种质特定位点上的基因型；

（5）分析待鉴定茶树种质基因；

所述步骤（2）中：

标记引物信息为：

TM352-F:CTTCTTCCTGTCGGGTTGAG，

TM352-R:GTCAACGGCCTATAACGGAA；

TM445-F:CCCAAATCCCAAGCTGTAGA，

TM445-R:ACGATCGAGCCTGCAATACT；

标记引物荧光染料为：

6-FAM、TET、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5中的任意一种。

2.根据权利要求1所述的一种快速鉴定茶树种质乌龙茶适制性的分子标记方法，其特征在于：所述步骤（1）具体步骤为：

将研钵中加入3mL1.5%CTAB溶液，取2.0g样品放到研钵中研磨均匀，吸取1.0mL研磨溶液转入2.0mL离心管中，置65℃水浴1h，间隔15min轻轻混匀1次；

冷却后，加入600uL的氯仿：异戊醇，其体积比为24:1，混匀，12000r/min，离心15min；

吸上清，转入新的1.5mL离心管，重复步骤1次；

吸上清，转入新的离心管中，加入1/3体积的3mol/L NaAc和1mL-20℃预冷的无水乙醇，混匀后置于-20℃静置30min；

12000 r/min，离心10min，弃上清；

加入75%乙醇洗涤2次，置于吸水纸上倒置晾干；

加入50uLddH₂O溶解，即为DNA。

3.根据权利要求1所述的一种快速鉴定茶树种质乌龙茶适制性的分子标记方法，其特征在于：所述步骤（3）中：

PCR反应体系：ddH₂O 16μL，10×Buffer 3μL，10 mmolL^-1 dNTP 3μL，MgCl₂ 2μL，10μmolL^-1F、R引物各1.5μL，0.5U Taq酶1μL，模板DNA 2 μL；

PCR热循环程序：94℃预变性5min，使模板DNA充分变性，然后进入下列温度循环：94℃变性1min，52 ℃退火1min，72℃延伸1min，重复35个热循环；72℃延伸20min，最后4℃保存。

4.根据权利要求1所述的一种快速鉴定茶树种质乌龙茶适制性的分子标记方法，其特征在于：所述步骤（4）中：

ROX500分子量标准工作液的配制：50ul ROX500分子量标准原液加950ul Hi-Di，配成1ml ROX500分子量标准工作液，4℃备用，-20℃长期保存；

在96孔板内加入1ul样品与10ul ROX500分子量标准工作液，震荡混匀，离心，使用3730xl型DNA分析仪检测PCR扩增产物，分别获得待鉴定茶树种质在TM352、TM445位点上的基因型；所述TM352、TM445位点分别对应的重复序列为GAGGTG、GTA。

5.根据权利要求1所述的一种快速鉴定茶树种质乌龙茶适制性的分子标记方法，其特征在于：所述步骤（5）中：

首先按照上述步骤（1）至步骤（4）分别获得待鉴定茶树种质在TM352、TM445位点上的基因型；

然后将其与适制乌龙茶的种质在TM352、TM445位点上的基因型比较，如果待鉴定茶树种质在这两个位点上的基因型与适制乌龙茶的种质在TM352、TM445位点上的基因型共同一致，则判定该茶树种质为适制乌龙茶的种质；所述TM352、TM445位点分别对应的重复序列为GAGGTG、GTA。