[发明专利]一种幽门螺旋杆菌多价表位疫苗及其制备方法

说明书

本发明提供一种幽门螺旋杆菌多表位疫苗，其活性是一条多肽，由尿素酶A和B亚基、黏附素HpaA、热休克蛋白HSP60的优势Th和B细胞抗原表位或区段以及中性粒细胞激活蛋白NAP和霍乱毒素B亚基构成。本发明通过基因合成技术合成一个人工基因，其包含尿素酶A和B亚基、黏附素HpaA、热休克蛋白HSP60的优势Th和B细胞抗原表位或区段以及中性粒细胞激活蛋白NAP的基因序列，将该人工基因与霍乱毒素B亚基基因相偶联，形成一个融合基因。通过大肠杆菌表达该融合基因，经蛋白纯化后，获得多价表位疫苗。该疫苗可激发机体产生针对尿素酶、黏附素HpaA、热休克蛋白HSP60和中性粒细胞激活蛋白NAP的T细胞免疫应答和抗体体液免疫应答，可用于防治幽门螺旋杆菌感染相关性疾病。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及到一种新型幽门螺旋杆菌多表位疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是慢性胃炎、消化性溃疡和十二指肠溃疡的重要致病因子，与胃癌密切相关，世界卫生组织(WHO)已将Hp列为I类致癌因子。幽门螺旋杆菌的感染率很高，世界人群Hp感染率超过50％，我国人群Hp感染率为58.07％，呈现家庭聚集性，形势更加严峻。目前治疗Hp感染的方法，主要基于抗生素“三联”药物疗法，其存在费用高、患者依从性差、耐药菌增多及肠道菌群失调等缺点，不宜在Hp感染人群中大规模推广使用。实验研究表明，免疫接种可预防甚至治疗Hp感染，使人群获得持久性的免疫力。研制有效的预防性和治疗性Hp疫苗是控制Hp感染性疾病的一种切实有效的方法，逐渐成为国内外学者竞相研究的一个热点。

幽门螺旋杆菌含有丰富的尿素酶(Ure)，约占全菌体蛋白的5％～10％，在Hp内部和表面广泛表达。一般细菌难以在胃部的高酸环境中存活，但Ure能水解尿素产生氨来中和胃酸，并可对胃黏膜造成病理性损伤。因此，尿素酶是Hp重要的定植因子和致病因子。尿素酶由A和B两个亚单位(UreA和UreB)组成，其中尿素酶B亚基是尿素酶活性亚单位，在各Hp菌株中具有很好的保守性，被公认为是Hp疫苗的理想候选抗原。最新实验研究表明，尿素酶A亚基同样具有较强的抗原性，针对尿素酶A亚基的Hp疫苗同样能够取得良好的保护作用；幽门螺旋杆菌黏附素HpaA是Hp鞭毛鞘膜蛋白，几乎存在于所有临床分离的Hp菌株表面，是Hp主要的黏附因子之一，且氨基酸序列高度保守，动物实验已证明HpaA是定植的必要因子，是Hp疫苗研制的一种理想的保护性抗原。幽门螺旋杆菌热休克蛋白(HSP)位于Hp表面，具有较强的免疫原性，能够诱发小鼠产生特异性抗Hp抗体。Hp热休克蛋白HSP60是Hp尿素酶的一种分子伴侣，介导Hp与胃黏膜细胞的黏附；幽门螺旋杆菌中性粒细胞激活蛋白(NAP)是Hp的主要毒力因子之一，对中性粒细胞、单核细胞有趋化作用，导致中性粒细胞浸润胃黏膜，并诱导中性粒细胞NADPH氧化酶激活，产生活性氧中间产物(ROI)，引起黏膜炎症和组织损伤。NAP抗原性强，大多数Hp感染患者产生NAP抗体。其次，NAP是一种很好的Th1型极化细胞免疫佐剂。

本发明的思路如下：根据机体对Hp的免疫保护性机制，合理选择尿素酶A和B双亚基、 黏附素HpaA、热休克蛋白HSP60的优势Th和B细胞抗原表位或区段以及分子内黏膜佐剂CTB和Th1型细胞免疫佐剂NAP，通过生物信息学软件对抗原表位或区段的连接顺序、间隔序列和多重拷贝数，加以分析和确定，设计出一个科学合理、结构新颖的Hp多价表位疫苗CWAE。利用Western Blot、ELISA等多种免疫学方法检测Hp多价表位疫苗CWAE的免疫原性和免疫特异性，研究表明Hp多价表位疫苗CWAE能够激发BALB/c小鼠产生针对尿素酶A和B双亚基、黏附素HpaA、热休克蛋白HSP60和中性粒细胞激活蛋白NAP的T细胞免疫应答和高滴度表位特异性抗体，具有很好的免疫原性和免疫特异性。

发明内容

本发明的第一个方面是提供了一种针对Hp关键黏附因子和毒力因子尿素酶A和B双亚基、黏附素HpaA、热休克蛋白HSP60和中性粒细胞激活蛋白NAP的Hp多价表位疫苗。

本发明的第二个方面是提供了Hp多价表位疫苗的制备方法。