[发明专利]一种利用PCR技术检测葡萄苗木中葡萄根瘤蚜的方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种利用PCR技术检测葡萄苗木中葡萄根瘤蚜的方法；具体涉及一种利用DNA扩增技术获得特异DNA条形码用于鉴定葡萄苗木是否携带葡萄根瘤蚜，并利用实时荧光定量PCR技术对携带样品进一步进行更为准确的定性定量，属于检验检疫分子生物学领域。

二、背景技术

葡萄根瘤蚜(Daktulosphaira vitifoliae Fitch.)是葡萄上的专性寄生害虫。葡萄根瘤蚜原产于北美洲，19世纪中叶随苗木传入欧洲，给欧洲葡萄栽培和葡萄酒产业造成了毁灭性打击，成为世界上第一个被列入检疫对象的有害生物。葡萄根瘤蚜以1龄若虫或越冬卵在葡萄根部的皮缝或枝条缝隙进行越冬，1龄若虫和虫卵很小，用肉眼甚至常规镜检的方法都很难检测到根瘤蚜的存在，特别是当苗木夹裹了土壤之后发现更为困难，这点与根结线虫能在一年生苗木上造成容易发现的结节明显不同。随着改革开放，我们团体或个人大量从国外引进或携带葡萄材料，从而埋下了隐患。2005年首先在上海马陆葡萄园发现葡萄根瘤蚜，其后在湖南怀化、陕西灞桥等地陆续发现了较大规模的根瘤蚜。可见，葡萄根瘤蚜在我国存在爆发、传播的风险极大，所以检疫、检控葡萄根瘤蚜的工作已迫在眉睫。目前绝大部分技术人员还不能有效辨别根瘤蚜为害，为了防止根瘤蚜随苗木进行大规模、远距离的传播，建立一种快速、准确、高效的检测方法已成为当务之急。

DNA条形码(DNA barcoding)技术是近年发展起来的利用一个或几个特异的DNA片段对地球上现有物种进行识别和鉴定的一项新的分子鉴定技术,最初只是用于动物类群物种鉴定的标准新型系统，而后上升到鉴定所有真核生物物种，同时也被成功应用于土壤病原体、真菌、细菌和线虫的鉴定，为许多入侵害虫的诊断和鉴定提供了强有力的技术支持。Herbert等(2008)曾用DNA条形码技术对可能含有根瘤蚜的土壤进行了鉴定，筛选到一对能够用于根瘤蚜鉴定的特异引物，并发现与其他鉴定方法相比，DNA条形码技术准确度较高。Bruce等(2010)也证明DNA条形码技术可用于土壤中根瘤蚜的快速鉴定。本发明首次将DNA条形码技术和实时荧光定量PCR技术用于葡萄苗木根部根瘤蚜的鉴定。本发明不仅使用了简单的PCR扩增技术进行根瘤蚜的定性，还创新性地使用了更灵敏更准确的实时荧光定量PCR技术，在检验鉴定结果准确可靠的同时还可以根据检测结果比较不同样品间根瘤蚜含量的多少，该方法有助于苗木根瘤蚜的检疫检验。

三、发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种利用PCR技术检测葡萄苗木中葡萄根瘤蚜的方法。内容包括提取葡萄根瘤蚜基因组DNA，根据葡萄根瘤蚜ITS2区设计根瘤蚜特异引物，以根瘤蚜基因组DNA为模板进行常规PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，如果扩增产物大小为114bp核酸序列，即说明样品含有根瘤蚜；进一步对含有根瘤蚜的样品进行实时荧光定量PCR分析，根据样品孔循环数与荧光强度之间的关系图可以直观的进行根瘤蚜含量的定性和定量。

一种利用PCR技术检测葡萄苗木中葡萄根瘤蚜的方法，包括以下步骤：

1、根据葡萄根瘤蚜ITS2序列设计特异性引物：

上游引物(ITS2-1)：5’-3’AATCCGCAGGTTATACGAACATC  SEQ.ID.NO 1

下游引物(ITS2-2)：5’-3’CGGTCTCGTCAAATTTCGGA     SEQ.ID.NO 2

2、提取基因组DNA

参照Lin、Walker(1996)和Downie(2000)的方法提取待检测样品DNA。

3、根瘤蚜特异DNA片段扩增：

使用上述待检测样品DNA进行PCR扩增。PCR扩增体系25μl:10倍的buffer 2.5μl，2.5mM dNTP 2μl，上下游引物(10mM)各0.5μl，模板DNA1μl，taq酶1U，用无菌水补齐。反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s,56℃退火30s，72℃延伸30s，进行32-35个循环反应。将PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳检测，凝胶成像系统下观察目的条带，若待检测样品扩增产物中含有114bp片段，则该待检测样品含有根瘤蚜。

4、实时荧光定量PCR检测根瘤蚜