[发明专利]一种利用PCR技术检测葡萄苗木中葡萄根瘤蚜的方法

权利要求书

1.一种利用PCR技术检测葡萄苗木中葡萄根瘤蚜的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)根据葡萄根瘤蚜ITS2序列设计特异性引物：

上游引物：5’-3’AATCCGCAGGTTATACGAACATC SEQ.ID.NO 1

下游引物：5’-3’CGGTCTCGTCAAATTTCGGA    SEQ.ID.NO 2

2)提取基因组DNA

提取待检测样品DNA；

3)根瘤蚜特异DNA片段扩增：

使用步骤2)所述待检测样品DNA进行PCR扩增；PCR扩增体系25μl:10倍的buffer 2.5μl，2.5mM dNTP 2μl，上下游引物(10mM)各0.5μl，模板DNA1μl，taq酶1U，用无菌水补齐；反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s,56℃退火30s，72℃延伸30s，进行32-35个循环反应；将PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳检测，凝胶成像系统下观察目的条带，若待检测样品扩增产物中含有114bp片段，则该待检测样品含有根瘤蚜；

4)实时荧光定量PCR检测根瘤蚜

将上述含有根瘤蚜的待检测样品DNA进行荧光定量PCR扩增；使用SYBR染料法，总反应体系为20μl：2×Ultra SYBR Mixture(With ROX)10μl，所述上、下游引物各0.5μl，模板为2μl，RNase-Free Water 7μl；反应程序采取两步法PCR：95℃预变性10min；95℃变性10s,60℃退火/延伸1min，进行40个循环反应，建立荧光定量PCR扩增曲线图，根据每个样品孔的荧光强度曲线变化判断根瘤蚜及其含量。