[发明专利]一种快速高效的从恶性胸腹水中分离纯化肿瘤细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种肿瘤细胞的分离方法，尤其涉及一种快速高效的从恶性胸腹水中分离纯化肿瘤细胞的方法。

背景技术

胸水是呼吸内科常见的临床病症,分为渗出性及漏出性两种，可由炎症性病变、肿瘤性病变、全身性疾病及某器官病变引起。其中恶性胸水主要有胸腔脏器的恶性肿瘤引起，尤其是在晚期肺癌中常见，发生率高达60%。且常呈进行性。发病原因主要是胸膜转移结节侵犯和阻塞毛细血管和淋巴管所致，故胸水中含有大量蛋白质和血液有形成分，血性胸水约占75%。

腹水是腹膜腔内过多的液体积聚，是临床常见的病理现象，由腹膜原发或转移性恶性肿瘤形成的腹水称为恶性腹水，其他原因形成的腹水称为良性腹水，其常见病因有肝硬化、肿瘤和结核性腹膜炎。也分为渗出性及漏出性两种，其中以血性腹水最为常见。

恶性胸腹水中多含有肿瘤细胞，对于临床上病因诊断，病情判断以及临床治疗策略的调整都有着十分重要的意义。同时从恶性胸腹水中分离纯化得到的肿瘤细胞，因其直接来源于病人病灶，是药物敏感性试验以及肿瘤研究中的重要的研究工具。目前，常用的从恶性胸腹水中分离纯化的方法有离心成渣法、密度梯度离心法和不连续密度离心法。不过，这些方法都存在不同的缺陷，如细胞收集量较少，分离与纯化步骤分离，纯化程度低，需要如肿瘤细胞分离液、淋巴细胞分离液等专门的分离纯化试剂等问题。而且上述方法操作时涉及多次较长时间高速离心，容易造成分离后细胞状态较差，细胞不贴壁，无法进行进一步研究。因此，研发一种新型的操作简单，分离高效，对细胞伤害小的分离纯化方法显得至关重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便的、快速高效的从恶性胸腹水中分离纯化肿瘤细胞的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种快速高效的从恶性胸腹水中分离纯化肿瘤细胞的方法，包括以下步骤：

(1) 无菌操作收集恶性胸腹水，分装于无菌离心管内，常温离心，得到细胞沉淀；

(2) 用无菌性PBS液体重悬细胞沉淀，得到肿瘤细胞混悬液，取肿瘤细胞混悬液沿离心管管壁加到离心管内的血清上，在离心管形成两层溶液，上层为肿瘤细胞混悬液层，下层为血清层；

(3) 将步骤(2)中的加入了肿瘤细胞混悬液的离心管静置5-8分钟，而后用巴氏吸管吸取管底部的血清且不破坏液体分层，取出的血清置于新的离心管中，加入无菌PBS液，常温离心，弃上清，获得纯化的肿瘤细胞。

所述步骤(1)的恶性胸腹水为血性胸腹水时，用红细胞裂解液收集并混匀所述细胞沉淀，常温离心，得到不含红细胞的细胞沉淀。所述红细胞裂解液包含139.6 mmol/L NH₄Cl，16.96 mmol/L Tris，用1 mol/L HCl调 pH至7.2，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。

所述步骤(1)中的离心条件为：转速1000-2000r/min，离心时间3-6分钟。

所述步骤(2)的血清相对于蒸馏水的比粘度为1.4-1.8。所述的血清可以是人源血清，也可以是动物源血清。作为本发明的一个实施例，所述血清为小牛血清。

所述步骤(2)中，肿瘤细胞混悬液的细胞浓度不超过10⁶个/ml；所述肿瘤细胞混悬液与血清之间的体积比为1:1-1.5，且血清高度不低于4cm。

所述步骤(3)中吸取管底部的血清的操作至少进行两次，每次吸取后，静置3-5分钟后再进行下一次吸取，每次吸取5-6ml血清。

所述步骤(3) 中的离心条件为：转速1000-2000r/min，离心时间3-6分钟。

本发明所述的无菌性PBS液体由0.27g磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，1.42g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)，8g氯化钠(NaCl)，0.2g氯化钾(KCl)，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.2-7.4，最后定容到1L，灭菌后室温密封保存。

本发明方法与现有技术相比具有以下有益效果：

(1)本发明采用的血清自然沉淀的方法同时进行肿瘤细胞的分离与纯化，简化操作步骤。

(2)本发明方法中涉及到的试剂均为温和的缓冲液及血清，并且方法过程中不涉及长时间的高速离心，对细胞伤害小，得到的肿瘤细胞状态好。

(3)本发明提供的分离纯化方法稳定性好，重复性好，得到的细胞纯度高，易于培养。