[发明专利]一种PRRSV、PCV2、PRV和CSFV的多重PCR检测试剂盒

权利要求书

1.一种检测PRRSV、PCV2、PRV和CSFV的多重PCR试剂盒， 其特征在于：包括反转录体系、2×NanoPCRMix和引物组合物，所 述的引物组合物为：

PRRSV的上游引物SEQIDNO.1和下游引物SEQIDNO.2；

CSFV的上游引物SEQIDNO.3和下游引物SEQIDNO.4；

PCV2的上游引物SEQIDNO.5和下游引物SEQIDNO.6；

PRV的上游引物SEQIDNO.7和下游引物SEQIDNO.8。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的反转录 体系为5×反转录缓冲液、dNTPMixture、反转录酶、RNA酶抑制剂 和反转录引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的反转录 酶为M-MLV反转录酶，所述的反转录引物为SEQIDNO.2。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的2×PCR Mix由DNA聚合酶、2×PCRbuffer和dNTPMixture组成。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒 还包括RNA提取试剂：TRIzolLSReagent、氯仿、异丙醇、75％乙 醇。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还 包括猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪 瘟病毒阳性对照。

7.一种PRRSV、PCV2、PRV和CSFV的多重PCR检测方法， 其特征在于：

1)病毒RNA的提取；

2)反转录反应：所得的病毒总RNA11μL，加入2μL10μM 的反转录引物，4μL5×反转录缓冲液、0.5μL反转录酶、0.5μ LRNA酶抑制剂、2μLdNTPMixture至20μL，42℃水浴1～2h， 即得到cDNA溶液；

3)病毒DNA的提取

将200μL经过预处理的待测样品用蛋白酶K消化1h，加入250ul 乙醇涡旋混匀，静置5min，用洗液洗涤2次，12000r/min离心2min， 将沉淀自然风干后，溶于适量无核酸酶的水中贮存于-80℃备用；

4)多重PCR反应

反应体系为：10μL2×PCRMix、1μL上述cDNA溶液、1μ L上述DNA溶液，0.5μL10μM的上游引物、0.5μL10μM的下游 引物，最后加入无核酸酶水至总体积为20μL；

反应条件为：94℃3min，1个循环；94℃10s，55℃30s，72℃ 30s，共30个循环；72℃5min1个循环；

5)经1％琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物，进行判断。

8.根据权利要求7所述的多重PCR检测方法，其特征在于：所 述的判断标准为：若出现321bp大小的条带则待测样品含有猪繁殖 与呼吸综合征病毒；若出现440bp大小的条带则待测样品含有猪圆 环病毒2型；若出现359bp大小的条带则待测样品含有猪伪狂犬病 毒；若出现186bp大小的条带则待测样品含有猪瘟病毒。

9.权利要求1所述的引物组合物。

10.根据权利要求9所述的引物组合物，其特征在于：所述引物 组合物在检测PRRSV、PCV2、PRV和CSFV中的应用。