[发明专利]表达和分泌人干扰素α2b的乳杆菌菌株及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，更具体地涉及人干扰素α2b的表达质粒及表达该蛋白的遗传工程菌株。

背景技术

大部分病毒，包括人乳头瘤病毒(HPV)和人单纯疱疹病毒(HSV)，通常在粘膜表面处侵入宿主。HPV感染已经成为世界范围内的流行病，仅在美国每年就有超过600万起新病例。世界上每年有数百万妇女被发现与HPV感染有关的可能是癌症前期的、异常的宫颈涂片。对于与HPV感染有关的宫颈病变，尚无可行的药物治疗手段。作为替代，人们努力实行外科或其他切除技术来破坏被感染组织并预防疾病进一步发展。由于不希望的副作用，这些做法通常只限于较晚期患者。宫颈糜烂是另一种因HPV宫颈感染引起的常见病症。临床上，宫颈糜烂与鳞状上皮细胞的部分或完全丧失有关。尽管已有新疫苗可预防HPV的初始感染，但是仍有数百万妇女被预期会感染HPV并发生癌症前期的宫颈病变，另外全世界已有数百万妇女被感染。

目前预防宫颈HPV感染的主要方法是预防性HPV疫苗。例如Merck&Co.公司以及GlaxoSmithKlineInc.公司已经开发出旨在防护HPV数种特异性亚型的感染的疫苗，分别称为和Cervarix。尽管这些疫苗具有带来显著医疗进步的可能性，然而它们主要是为了提供一种手段来预防青少年初始感染，而不是治疗已经发生感染的患者。这些疫苗主要意在预防而非治疗，从而限制了其应用范围。此外，它们的有效范围和持续时间具有明显的限制。例如，Merck成功地开发了用于9-26的女孩/妇女对HPV的防护，但只针对HPV的6型、11型、16型和18型。HPV-16引起约50％的宫颈癌，而16型、18型、31型和45型一共引起80％的癌症。因此，或其他疫苗并非对所有可能导致癌症的HPV亚型有效。

生殖器疱疹是由单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和单纯疱疹病毒2型(HSV-2)引起的，全球发病率较高。虽然大多数感染者无症状，但也有感染者出现严重的临床表现，尤其是免疫缺陷患者。生殖器溃疡在世界范围内都很普遍，其中50％-80％可分离到HSV。在许多国家，HSV-1血清型阳性率超过80％-90％，15岁-49岁的全球人口中有16％以上感染HSV-2。在美国，HSV-1的感染率为约58％，HSV-2为16％。HSV的复发，定义为HSV再活化并导致明显的临床症状。原发性生殖器HSV-1的复发率为57％，HSV-2为89％。生殖器HSV-1感染的患者平均每年有1.3次复发，而HSV-2感染每年的中位复发次数为4次。HSV-2的较高复发率再次反映了特异性。

鉴于该疾病的严重性，生殖器疱疹的预防和治疗十分关键。HSV疗法在过去十几年的中流砥柱是三个抗病毒药物：阿昔洛韦、泛昔洛韦和伐昔洛韦。这些核苷类似物，其抑制病毒DNA聚合酶，可以在症状初现(即7-10天)和复发(即1-5天)时服用，以及每日服用抑制病毒。虽然该方案可减轻病变的严重程度和降低脱落率，但并不能消除脱落和传播风险。治疗性疫苗是另一个潜在的治疗措施。事实上，许多早期的HSV疫苗试验研究基本上是不成功的。因此，需要新的治疗方法。

干扰素是一组人体天然存在的抗病毒感染的细胞因子。干扰素已被用于治疗许多病症，包括病毒或细菌感染。人干扰素(IFN)α2b是I型IFNα家族的一员，具有许多生物学作用，包括广谱抗病毒效应、抑制肿瘤细胞增殖和增强免疫功能。基于IFNα2b的疗法已用于治疗宫颈上皮内瘤变{Chakalova2004}和皮肤鳞状细胞癌{Edwards,1992}。对于这些治疗，重组IFN-α2b通过全身给药患者。这些治疗经常需要较高的药物剂量、严格的药物保存条件和高昂的生产费用。

由于健康个体的粘膜密布着以乳杆菌属(Lactobacillus)(每克液体10⁷-10⁹CFU)为主的共生细菌{Sobel,1996}，因此可利用这些细菌来递送小蛋白或肽以防止粘膜传播病毒在这些位置处的传播。

发明内容

本发明的第一方面提供了一种表达IFN-α2b蛋白的质粒，其通过将SEQIDNo:1的人成熟IFN-α2b编码区(编码C-末端24-188位氨基酸残基)克隆到pOSEL144中的NheI和MfeI位点而获得，所述质粒中的基因表达盒包括P₂₃启动子、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)S-layer基因从核糖体结合位点到信号肽酶切割位点的信号序列以及在3’末端带有TAA终止密码子的IFN-α2b蛋白编码区，所述基因表达盒的序列如SEQIDNo:2所示。