[发明专利]一种基于聚电解质多层膜基片电泳流动型ELISA方法

说明书

技术领域

本发明属于生物材料领域，特别涉及聚电解质多层膜(polyelectrolytemultilayers:PEMs)的制备，电泳驱动下的酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法。

背景技术

近年来，自免疫方法被确立以来，免疫传感器作为新兴的生物传感器，以其鉴定物质高度特异性、灵敏性和稳定性受到青睐。ELISA是少量蛋白质检测和定量的试验方法，广泛的应用于食品、工业、环境监测、和临床医学等领域。ELISA在常规的聚苯乙烯基板(polystyrene：PS)基板上的静态温育反应存在以下几个问题：(1)在PS上的第一抗体容易变性，并且与抗原反应的部位不容易裸露在基片表面；(2)封闭效果不佳，导致抗原及第二抗体的非特异性吸附，影响了ELISA系统的灵敏度；(3)在抗原抗体反应过程中，抗原需要长时间的自由扩散，长时间的温育反应成为限速步骤，导致缓慢的结合速度，影响了分析的灵敏度和动态量程。虽然有很多通过纳米材料制备来提高ELISA系统灵敏度的研究，但其操作复杂及成本过高，导致难以实际应用。另外，微细加工芯片牌组器、微阵列芯片、微流体技术，却由于其表面修饰技术的欠缺、操作的复杂性等弊端不能广泛的应用于高灵敏度的临床检测。此外，通过外力提高抗原在第一抗体附近的局部浓度，能够提高灵敏度的同时，还能大大缩短反应时间。Punyadeera[Lieshout,R.M.L.van；Domburg,T.van；Saalmink,M.；Verbeek,R.；Wimberger-Friedl,R.；Dieijen-Visser,M.P.van；Punyadeera,C.Anal.Chem.2009,81,5165–5171]，Bruening[Dai,J.；Baker,G.L.；Bruening,M.L.Anal.Chem.2009,78,135–140]等通过压力方式将检测样品流动并透过第一抗体固定的多孔膜的同时进行抗原-抗体反应，有效地提高了检测效率及灵敏度，但是压力式流动系统对于混合样品(血清、全血)的检测没有初步筛选过程，导致多孔膜容易堵塞，限制了检测效率与灵敏度的提高。针对以上ELISA系统的检测弊端，因此，寻找一种可以“快速-灵敏-简便”检测ELISA系统显得尤为重要。将高分子功能膜的化学修饰与电泳技术有机融合在ELISA系统中，解决常规ELISA体系非特异性吸附高、反应效率低、混合样品检测困难等问题，具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于解决ELISA系统中样品检测低效率问题并进一步解决低灵敏度的问题而提供一种电泳流动型ELISA的方法，尤其提供一种聚电解质多层膜基片电泳流动型ELISA的方法，以解决背景技术中存在的问题。本发明所提供的聚电解质多层膜基片电泳流动型ELISA方法中，正电性PEMs修饰多孔膜，大幅度提高封闭剂蛋白的吸附量，有效抑制抗原和第二抗体的非特异性吸附。其次电泳技术作为ELISA体系中抗原流动检测的驱动方式，大大缩短了检测时间，提高了检测效率。

本发明所提供的电泳流动型ELISA方法，所采用的技术方案是：

(1)将第一抗体吸附到多孔膜基片上；

(2)吸附第一抗体的多孔膜基片再进行封闭剂蛋白吸附；

(3)电泳驱动抗原-第一抗体反应：将步骤(2)第一抗体和封闭剂蛋白吸附后的多孔膜基片固定在电泳装置中，电泳装置中多孔膜基片一侧注入抗原溶液(即电泳溶液)，多孔膜基片另一侧注入磷酸盐缓冲溶液，若抗原分子为负电荷则抗原溶液侧插入负电极，另一侧插入正电极，反之则反。电极加电压，进行抗原-第一抗体反应。

(4)第二抗体-抗原反应，对酶标第二抗体进行显色定量：步骤(3)电泳驱动抗原-第一抗体反应后，将电泳后的多孔膜基片放入到第二抗体溶液中，进行反应，然后清洗，将所得多孔膜基片放入第二抗体标识酶的底物溶液中，进行显色；通过检测吸光度，进行抗原定量分析。

优选上述多孔膜基片步骤(1)多孔膜基片是醋酸纤维素多孔膜(CA)或聚电解质多层膜修饰的CA多孔膜，聚电解质多层膜修饰的CA多孔膜是依次利用聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和聚苯乙烯硫酸钠交叉层叠修饰的CA多孔膜，且修饰的最外层是聚(二烯丙基二甲基氯化铵)，得到正电性的PDDA/PSS修饰CA，即PEMs-CA(优选PEMs-CA中聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和聚苯乙烯硫酸钠交叉层叠修饰7层)，通过其表面电荷性提高第一抗体与封闭剂(卵清蛋白ovalbumin:OVA)的吸附量，提高抗原与抗体反应的密度(信号)、抑制抗原和第二抗体的非特异性吸附(噪音)，进而大幅度提高灵敏性(信号与噪音比例)。