[发明专利]一种长春新碱的ELISA检测方法

权利要求书

1.一种长春新碱ELISA检测方法，其特征在于，步骤包括：

(1)长春新碱人工免疫原和包被抗原的制备；其制备步骤为：

1)长春新碱加入20-30％肼乙醇溶液中，室温下反应24小时，过滤，减压浓缩去溶剂，300-400目硅胶柱层析分离，得到4-去乙酰-长春新碱，将4-去乙酰-长春新碱和琥珀酸酐溶于无水吡啶中，60℃减压回流6小时，冷却至室温后有白色沉淀生成，过滤，得到4-长春新碱-半琥珀酸酯；

2)取4-长春新碱-半琥珀酸酯和载体蛋白溶解在pH 8.0缓冲液中，充分震荡使其溶解，再取乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，充分溶解于pH 8.0缓冲液中；

3)将得到的4-长春新碱-半琥珀酸酯和载体蛋白混合溶液边震荡边滴加入乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液，在摇床上37℃反应4小时，再用Sephadex柱分离偶联产物和未结合的小分子，经过透析、纯化、冻干后即得；

(2)长春新碱抗体的制备；

(3)利用长春新碱抗体与包被抗原组合，建立ELISA检测方法。

2.根据权利要求1所述的ELISA检测方法，其特征在于，所述的载体蛋白质为卵清蛋白、多聚赖氨酸或钥孔血蓝蛋白。

3.根据权利要求1所述的ELISA检测方法，其特征在于，长春新碱人工免疫原免疫动物，得到长春新碱抗体，所述的免疫动物为大鼠、小鼠或兔。

4.根据权利要求1所述的ELISA检测方法，其特征在于，步骤包括：(1)将制备的长春新碱包被抗原溶于包被缓冲液中，包被于96孔板上；(2)用100-200μL 5-10％的脱脂乳封闭96孔板，60-90分钟；(3)洗板、拍干后，向孔中加入50-100μL待检含长春新碱的血浆，50-100μL长春新碱抗体稀释液，37℃反应60-90分钟；(4)洗板、拍干后向孔中加入50-200μL酶标二抗溶液，37℃反应30-60分钟；(5)洗板、拍干后向孔中加入底物显色溶液，显色，终止反应。