[发明专利]一种抗PD-1的单克隆抗体及其获得方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗体工程技术领域，具体涉及全人源的抗PD-1的单克隆抗体、及其获得方法与应用。

背景技术

免疫调节在机体免疫应答过程中起着极其重要的作用，而免疫活性细胞的活化对整个免疫应答的调节极其关键。研究表明，T细胞活化和增殖依赖于双重信号途径。“协同刺激信号”的概念是1970年Bretscher和Cohn在T细胞活化双信号模型的基础上提出来的，即T细胞的活化不仅需要通过APC递呈MHC-抗原肽复合物给抗原特异性T细胞来提供第一信号外，还需要多种协同刺激分子参与提供辅助的第二信号(协同刺激信号)；随着研究的深入，协同刺激信号逐渐成为免疫学的热点领域；这些协同信号分子主要包括CD28/B7和TNFR/TNF两大超家族。PD-1/PD-L1作为CD28/B7超家族的成员，能介导负性协同刺激信号。PD-1/PD-L1信号通路能有效抑制T、B细胞功能，使T细胞增殖受抑，同时减少细胞因子IL-2、IL-10和IFN-γ的分泌，在免疫调节中发挥着重要的作用，并在肿瘤免疫、自身免疫、移植免疫、哮喘、病毒感染等疾病的研究中有着重要的意义。

PD-1属于免疫球蛋白超家族I型跨膜蛋白，分子量约为50-55KD。最初是在凋亡的T细胞杂交瘤中通过消减杂交技术得到的，因其与细胞凋亡有关故命名为程序性细胞死亡因子1(ProgrammedCellDeath1)。PD-1的编码基因是PD-CD1，定位于人染色体2q37.3，和CTLA4基因具有23％的同源性。PD-1由胞内区、跨膜区和胞外区构成，其胞外区包含一个免疫球蛋白可变区IgV样结构域；其胞内区N端的两个酪氨酸残基与其他氨基酸残基共同组成了一个免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)，ITIM通过酪氨酸的磷酸化发挥拮抗抗原受体刺激信号的功能，从而在免疫应答过程中发挥负性调控功能；PD-1分子可在活化的T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和树突状细胞表面诱导性地表达，并与其配体PD-L1、PD-L2相结合而对淋巴细胞的活化产生抑制作用，从而抑制免疫细胞的免疫应答反应。

PD-L1(CD274或B7H1)和PD-L2(CD273或B7DC)是PD1的两个配体，这两个配体基因均定位于人染色体9p24.2，并起始于同一方向，间隔42kb左右；它们同属B7家族，因而同其他成员一样，在蛋白结构上PD-L1和PD-L2均由IgV样结构域、IgC样结构域、跨膜区和短而保守的胞质区尾巴组成；与PD-L2相比，PD-L1的胞质尾巴在不同种属间更为保守。PD-L1在活化的T细胞、B细胞、树突状细胞、单核细胞和多种类型的肿瘤细胞(如肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、头颈癌、食道癌、皮肤癌、鳞状细胞癌等)上诱导性表达；PD-L2主要表达于活化的巨噬细胞、树突细胞和个别肿瘤细胞(如霍奇金淋巴瘤)上。肿瘤表面的PD-L1与PD-1相互作用，可导致肿瘤抗原特异性T细胞凋亡，使肿瘤细胞逃脱机体免疫监控。抗PD-1的单抗通过阻断PD-1/PD-L1信号通路促进肿瘤抗原特异性T细胞增殖，发挥杀伤肿瘤细胞的作用，能有效提高免疫治疗效果，具有治疗多种类型肿瘤的潜力。

目前多家大型国际制药公司都在进行针对PD-1或PD-L1的单抗药物(如表1所示)，其中百事美施贵宝的PD-1抑制剂Opdvio(Nivolumab)于2014年7月获日本批准上市；默沙东的PD-1抑制剂于2014年9月获FDA批准上市；这两个药物的首个适应症均为黑色素瘤。随着各公司临床项目的推进，适应症已扩展到肺癌、乳腺癌、血液癌症等领域。

表1、当前正在开展临床实验的抗PD-1抗体

目前全人源性抗体是治疗性抗体发展的主要方向，抗体库技术的出现为人源抗体的制备筛选提供了良好的技术平台。抗体库技术绕过了以往单抗研制过程中必须的杂交瘤过程，甚至不需要经过免疫过程即可获得各种抗体基因及抗体分子片段。噬菌体抗体库是最早出现也是目前应用最广泛的抗体库。

噬菌体展示技术是由Smith首先建立的一种将编码外源蛋白或多肽的基因插入噬菌体衣壳蛋白基因，使外源蛋白或多肽与噬菌体衣壳蛋白融合表达于噬菌体表面的技术。噬菌体抗体库就是利用了上述原理将不同特异性的抗体或其功能性片段(Fab、Fv、ScFv)表达在噬菌体表面，再用抗原进行筛选。噬菌体抗体库根据抗体基因的来源分为免疫库和非免疫库，非免疫库又包括天然库、半合成库和全合成库。噬菌体抗体库的筛选模拟了抗体亲和力成熟的过程，通常将抗原包被在固相介质上，加入待筛选的噬菌体抗体库，通过数轮“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的过程(即淘选)直至筛选到高亲和力特异的抗体。