[发明专利]基于农杆菌介导的冬芽注射的桑树转基因方法

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种农杆菌介导的桑树转基因方法。

背景技术

木本植物大多为多年生植物，相对于农作物等一、二年生草本植物而言，一般具有生命周期长、成熟开花晚、遗传背景复杂等特点，其遗传转化方面的研究一直相对滞后。近年来，随着农杆菌介导的植物遗传转化的快速发展，研究者们已经相继在杨树（Populus L.）、刺槐（Robinia pseudoacacia Linn. ）、苹果（Malus pumila）、桃（Amygdalus persica L.）、柑橘（Citrus reticulata Blanco.）等木本植物中成功建立了遗传转化体系。这些木本植物的遗传转化都是利用其叶、茎等组织易于培养和再生的特点，通过与农杆菌共培养，诱导再生出丛生芽后，筛选获得阳性丛生芽，再进一步培养成转基因株系。

桑树是一种多年生木本植物，具有很强的环境适应能力、耐修剪和种苗易繁育等优良林木树种特点，具有改善空气质量、保水固土防沙等优良生态功能，不仅其叶是家蚕唯一食料来源，其果、叶、枝、皮还皆为良药，所含的氨基酸和抗氧化物质十分丰富。因此，桑树生物资源的多用途开发价值和潜力巨大，其多元化开发研究对推动以获取桑叶养蚕为唯一目的的传统蚕桑产业的升级转型具有重要意义。桑树多元化利用的关键是筛选和创造具有不同用途的专用品种和育种素材，如专用药用桑、生态用桑和食用桑等，为桑树多元化产业开发奠定基础。随着桑树基因组测序的完成，桑树研究正式步入功能基因组时代。转基因技术是目前创造新素材和功能基因研究的最重要平台之一。但到目前为止，高效实用的桑树转基因技术体系尚未建立起来。虽然部分学者通过农杆菌介导的叶盘转化法和基因枪外源基因导入法开展了桑树转基因研究并取得了很大进展，但利用叶、子叶等组织的叶盘转化法受到组织培养严格繁琐操作和桑树再生体系难以建立的限制，目前还只能在个别桑树品种（如再生能力强的印度桑和新一之濑）中获得成功，而且这些技术可重复性较差，目前只在极少几个研究小组取得了突破，还难以有效的应用于桑树功能基因组研究和多元化开发研究中。因此，现在迫切需要发展一套高效实用的桑树转基因技术体系，有效的创造新的研究材料和育种素材，来支撑桑树的功能基因组研究和传统蚕桑产业的升级转型。

发明内容

鉴于现有桑树转基因技术存在桑树再生系统建立困难、转化成功率低、技术可重复性差以及仅限于个别桑树品种的缺点，本发明的目的在于提供一种新型高效实用的桑树转基因方法，摆脱实验室及组织培养繁琐步骤的束缚，无需探索建立组织再生系统，能够在自然环境下实施，转化效率高，可以快速获得转基因植株及其后代，技术可重复性好，而且普遍适用于不同桑树品种和资源。

具体技术方案如下：

基于农杆菌介导的冬芽注射的桑树转基因方法，包括以下步骤：

（1）将含有目的基因的农杆菌工程菌接种到含有筛选压的液体培养基中进行扩大培养，当菌液OD600值达到0.8～1.2时分离菌体，用悬浮培养基重悬浮，再加入乙酰丁香酮，获得农杆菌工程菌转化液；所述悬浮培养基为含有渗透剂和表面活性剂的1/2MS（Murashige-Skoog）培养基；

（2）选取待转化桑树品种枝条上将要萌发且个体体型较大的冬芽，将冬芽生长点刺伤后注入农杆菌工程菌转化液至溢出为止，用脱脂棉包裹注射后的冬芽；重复此步骤向选取冬芽连续注射农杆菌工程菌转化液5～7次，每天1次；

（3）对注射后冬芽长出的叶片进行转基因鉴定，筛选出阳性枝条；

（4）筛选出的阳性枝条通过嫁接无性繁殖或桑雌果和雄花的杂交有性繁殖获得转基因嫁接桑苗或转基因桑树种子。

进一步，步骤（1）中所述农杆菌为根瘤农杆菌LBA4404。

进一步，步骤（1）中所述悬浮培养基为含有5wt% D-葡萄糖、0.05wt% Silwet L-77和0.05wt% MES（2-吗啉乙磺酸）的1/2MS培养基（本文中的符号“wt%”均表示质量百分浓度）。

进一步，步骤（1）中所述菌体用悬浮培养基按体积比1:1重悬浮。

进一步，步骤（1）中所述农杆菌工程菌转化液中乙酰丁香酮的终浓度为100～200 μmol/L。

进一步，所述桑树品种为红果1号和珍珠白。