[发明专利]海马的鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及海马的鉴定方法，属于分子生物学领域。

背景技术

海马是硬骨鱼纲(Osteichthyes)海龙目(Syngnathiformes)海龙科(Syngnathidae)海马属(Hippocampus)鱼类的统称,在东亚地区主要作为传统药材被人们加以利用。海马为我国传统名贵中药材，首载于《本草经集注》。2010版《中国药典》收载海马为海龙科动物线纹海马Hippocampus.kelloggi Jordan et Snyder、刺海马Hippocampus.histris Kaup大海马Hippocampus kuda Bleeker、三斑海马Hippocampus.trimaulatus Leachh或小海马Hippocampus japonicus Kaup5种(《中国鱼类系统检索》记载线纹海马H.kelloggi为大海马,大海马H.kuda为管海马，小海马H.japonicus为日本海马H.mohnkei,本研究采用《中国鱼类检索》所载海马名称)均被列入CITES(the Convention on Internaitional Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora)附录II。

全世界海马约有33种，也有报道为35种。普遍认为，我国近海海马主要有6种，即日本海马、冠海马、三斑海马、大海马，刺海马及克氏海马等。海马是珍贵的海洋药源动物，有极高的经济价值和药用价值，全世界不少于51个国家和地区在进行海马的贸易。有报道称：仅1995年，全球约至少有2千万只的海马被交易，用于中药材、养殖和观赏等方面，而最大的进口地区依次为中国大陆、台湾省及香港，每年的进口量分别为20、11、7吨。海马种类复杂，流通种类同药典差异较大，近年来掺假掺伪、以次充好、错用及混用等现象愈演愈烈，严重影响了海马药材临床用药安全，为其质量控制和规范市场销售秩序带来较大的困扰。

现有海马的真伪鉴别包括外观形状鉴别，显微鉴别等传统方法，扫描电镜，高效毛细管电泳，高效液相指纹图谱,X射线衍射等化学鉴别方法。传统的形态学鉴别手段经验化要求高，而化学鉴别操作繁琐，多需要大型仪器。与之相比，分子标记具有稳定，不受器官和环境因素影响的特点，目前以聚合酶链式反应[PCR]为基础的的技术已逐步成为中药鉴定的核心方法如DNA条形码，SCAR,ISSR，RAPD等多种分子标记技术已广泛应用于中药鉴定。目前已报道用于海马的分子鉴别方法操作复杂(PCR-RFLP)、周期长(DNA barcoding)，已不能满足对海马掺伪现象的控制和监管需要，建立科学、准确、快速、高通量的海马真伪鉴定方法已十分必要。特异引物PCR技术以其简单、快速、准确及成本低等优点，备受检验检疫部门青睐。该技术目前在石斛，鳖甲，金银花，紫苏中已有报道，2010版《中国药典》已收录该方法为蕲蛇，乌梢蛇的分子鉴定方法，目前尚未见该方法用于海马鉴定。

长期以来DNA的提取一直是DNA分析技术实验中最耗时、繁琐的步骤，严重制约了分子鉴定方法的使用和推广。快速提取DNA一直是分子研究者的目标和追求，煮沸碱裂解法是一种有效的DNA快速提取方法，目前已广泛用于小麦、花生、水稻等，在分子辅助育种、转基因植物鉴定、SSR鉴定等众起到了重要作用。碱裂解法[通过0.2M～1M的氢氧化钠或氢氧化钾处理材料，裂解细胞并获得DNA，方法简单，操作步骤少、步骤少、不需要酚、氯仿等有毒试剂。蒋超等采用碱裂解法提取了144种中药材的DNA并进行DNA条形码扩增，均可扩增出明显条带。

PCR扩增是各种分子标记的基础，常规扩增过程一般耗时3h左右，快速PCR(rapdi PCR或fast PCR)是指在保证PCR扩增反应结果准确性的前提下，尽量缩短PCR反应时间，实现快速扩增。目前主要在临床快速诊断、病原体快速检测、药物快速鉴别、动植物DNA快速检测等方面有较广泛的实际应用。